论文部分内容阅读
【背景】肝纤维化由各种持续的慢性肝损伤导致，其渐进性发展最终可形成肝硬化，甚至诱发肝癌，严重危害人们的生命健康。针对晚期肝硬化的有效治疗手段十分有限，但有效的治疗可以逆转肝纤维化，甚至恢复肝脏正常的结构和功能。因此，探索治疗肝纤维化的有效方法具有重要意义。目前，针对肝纤维化的细胞治疗具有广阔的临床应用前景。肝纤维化是肝内胶原纤维异常沉积的过程，是肝损伤后的伤口愈合反应。各种慢性肝脏疾病，导致肝细胞变性、坏死和凋亡，招募多种炎症细胞浸润。在肝内多种细胞的相互作用下，肝星形细胞活化，其合成和分泌大量细胞外基质，基质生成和降解失衡、大量沉积，导致肝纤维化。而在此过程中，巨噬细胞发挥着重要的调控作用。巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞。在肝纤维化的发展过程中，巨噬细胞起着双刃剑的作用。一方面，活化的巨噬细胞分泌大量细胞因子，导致肝星形细胞激活并合成分泌大量胶原蛋白；另一方面，巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶类，降解胶原纤维，诱发肝星形细胞凋亡，促进肝纤维化的消融缓解。提示纤维化过程中，巨噬细胞的功能复杂多样，具有一定的异质性。大量研究表明，活化的巨噬细胞可分为经典激活的M1型巨噬细胞和替代激活的M2型巨噬细胞。二者对肝纤维化的作用不同，分别具有抗纤维化和促进纤维化的作用。目前的研究表明，骨髓来源的巨噬细胞回输对肝纤维化具有一定的缓解作用，但关于不同极化类型巨噬细胞对肝纤维化的治疗研究尚未见报道。因此，本课题拟培养骨髓来源的巨噬细胞，用不同因子刺激诱导成为不同极化类型，将其回输给肝纤维化模型小鼠，观察其对肝纤维化的作用，并探讨其机制。【目的】1.研究不同极化类型的巨噬细胞回输对小鼠肝纤维化的影响。2.研究不同极化类型的巨噬细胞回输参与肝纤维化治疗的机制。【方法】1.CCl4腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型。2.建立巨噬细胞分离培养和极化诱导的方法。3.用PEI-SPIO/Cy3-RNA复合物标记巨噬细胞，追踪巨噬细胞回输后在肝脏中的定位。4.回输不同极化类型的巨噬细胞，用天狼星红染色、肝脏羟脯氨酸测定、Desmin免疫组化染色和血清白蛋白检测等方法评价细胞回输后肝纤维化程度的变化和治疗效果。5.实时定量PCR、流式细胞术及明胶酶谱法检测不同极化类型的巨噬细胞中基质金属蛋白酶和巨噬细胞趋化因子配体的表达水平。6.不同极化类型巨噬细胞回输后，用实时定量PCR检测肝脏组织中巨噬细胞趋化因子配体和基质金属蛋白酶的表达、用免疫组化检测肝脏组织中F4/80+巨噬细胞的浸润数量、测定尿液中羟脯氨酸的含量。【结果】1.成功建立小鼠肝纤维化模型；成功获得骨髓来源的巨噬细胞，并在不同诱导条件下得到M1和M2型巨噬细胞；尾静脉回输巨噬细胞可定位于肝纤维化区域。2.天狼星红染色、肝脏羟脯氨酸测定、Desmin免疫组化染色和血清白蛋白水平显示，M0和M1型巨噬细胞回输组小鼠肝脏胶原纤维沉积减少，其中M1型巨噬细胞回输组减少更明显，小鼠肝功能更好。提示M1型巨噬细胞回输对肝纤维化有更好的治疗效果。3. M1型巨噬细胞高表达MMP-2、9、13和CCL2、CCL3。4. M1型细胞回输组小鼠肝脏组织中高表达CCL2、CCL3和MMP-2、9、13，F4/80+巨噬细胞浸润增多，尿液中羟脯氨酸含量最高。【结论】1.M1和M0型巨噬细胞均可缓解小鼠肝纤维化，尤以回输M1型细胞疗效更为显著。2.M1型巨噬细胞本身高表达的MMPs分子，招募自体巨噬细胞向肝脏募集，并分泌大量MMPs，二者协同作用，加速胶原纤维的降解，肝纤维化减轻。