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研究背景和目的:间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,可向骨、软骨、脂肪、心肌、肝脏、神经、皮肤等多胚层组织细胞分化。此外,MSCs还具有强大的免疫调节能力,在器官组织再生修复、移植、肿瘤治疗等临床应用方面具有广阔的前景。MSCs体内应用的一个重要前提是体外安全和高效的扩增。较多研究发现MSCs在体外长期培养后会自发恶性转化,且MSCs参与了肿瘤的形成,然而其分子机制并不是很清楚。本研究首先对长期体外培养的家猪骨髓MSCs(BMSCs)在细胞形态、核型分析、软琼脂克隆实验、小鼠体内成瘤等方面进行研究,观察体外长期培养下的BMSCs是否会出现自发性恶性转化及产生成瘤性,并进一步探讨长期培养的家猪BMSCs基因表达谱和DNA甲基化状态并进行联合分析,以阐明甲基化在调节基因表达上与BMSCs发生转化的关系,最后探讨NOTCH信号通路在诱导BMSCs增殖和转化中的可能作用。方法:1、选取3月龄雌性长白猪6头,体质量约50 kg,无菌条件下于胫骨近端抽取骨髓。采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对BMSCs进行分离、纯化、体外传代培养及鉴定。细胞恶性转化通过细胞形态、核型分析、软琼脂克隆形成实验、血清依赖性实验、肿瘤相关基因表达以及免疫缺陷小鼠成瘤实验进行验证。2、使用定制的家猪甲基化芯片和Agilent全基因组表达谱芯片,通过生物信息学分析获得第1代MSCs(早期)和第25代MSCs(晚期)差异的DNA甲基化谱和mRNA表达谱,并进行mRNA-甲基化的关联分析,同时对这些基因进行生物信息学分析。3、原代分离小鼠BMSCs,将siRNA NOTCH1的干扰载体、空载体分别加入细胞中,并用γ-分泌酶抑制剂作用24h,实验分组为:1)正常对照组2)siRNA空载组3)siRNA NOTCH1组4)γ-分泌酶抑制剂组5)siRNA NOTCH1+γ-分泌酶抑制剂组。CCK8检测细胞的增殖情况,qRT-PCR和WB分别检测NOTCH1、TGF-β1、c-Myc、p53 mRNA和蛋白相对表达情况,通过成骨分化来观察BMSCs的分化情况。结果:1、长期培养的BMSCs逐渐表现出转化细胞的特性:随培养及传代时间延长,其平均倍增时间缩短,并出现异倍体核型,血清依赖程度显著降低,并在软琼脂培养基中独立生长并形成克隆,肿瘤相关基因表达出现差异,p53和Fas基因表达被抑制,同时c-Myc和NOTCH1、Hes5表达上调,在小鼠体内形成肿瘤样组织。2、全基因表达谱芯片筛选出转化过程中上调表达的257条基因和下调的315条基因,信号通路分析发现部分细胞周期相关基因表达上调,部分ECM-receptor interaction、Focal adhesion、Regulation of actin cytoskeleton、Pathways in cancer、p53等通路相关基因表达下调;甲基化芯片分析得到受甲基化调控的962条差异基因和1219条受去甲基化的基因,并发现这些基因主要参与细胞代谢、增殖分化、细胞结构、炎性免疫、肿瘤发生等生物过程;同时发现有42个高甲基化的miRNA和17个低甲基化的miRNA。联合分析BMSCs转化过程受甲基化调控的基因,发现35个基因的甲基化改变与表达异常方向相反,其中21个基因启动子区甲基化程度升高而基因表达下降,14个基因启动子区甲基化程度下降而基因表达升高;同时KEGG信号通路分析发现多个受甲基化调控、参与干细胞分化的基因及参与的多个细胞信号通路,其中在14条甲基化下调而表达上调的基因中,很多具有调节肿瘤发生与免疫炎性相互平衡的作用,其中CDKN3启动子区甲基化状态改变,可能与细胞肿瘤化密切相关。3、干扰NOTCH信号通路后,BMSCs增殖能力明显下降,同时NOTCH1、TGF-β1、c-Myc基因表达也降低,显著低于对照组,而抑癌基因p53表达显著高于对照组。干扰NOTCH信号通路后BMSCs分化能力也出现变化,siRNA NOTCH1增加成骨分化,这些间接说明NOTCH通路对BMSCs增殖有促进作用而对BMSCs的分化有抑制作用。结论:1、与早期正常BMSCs比较,体外长期培养的BMSCs发生了自发恶性转化并具有成瘤性。p53、Fas基因表达下调以及c-Myc、NOTCH1、Hes5表达上调,提示NOTCH信号通路可能参与了BMSCs的恶性转化。2、甲基化参与BMSCs的自发恶性转化。3、NOTCH信号通路对于BMSCs有促增殖作用,可能通过上调c-Myc表达,下调p53表达。NOTCH通路对BMSCs正常分化可能存在抑制作用。这些结果提示NOTCH通路对于BMSCs恶性转化可能有一定影响。