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目的:肺癌是中国目前死亡率非常高的恶性肿瘤，发病率与死亡率均居于首位，超过胃癌和食管癌。在中国这样的发展中国家，随着环境的污染以及中国的吸烟人数位居世界之首都造成了肺癌在中国的发病率逐年上升。然而目前肺癌的治疗方法仍不是十分理想，手术治疗仅适用于早期肺癌，五年生存率仅有15％。在肺癌的发病中，非小细胞肺癌约占肺癌总敉的80-85％。临床一线的化疗药物对非小细胞肺癌有效率仅有40％，且容易产生耐药性。因此，开发新的化疗药物和用药策略成为目前肺癌治疗的首要任务。 土木香是菊科多年生草本植物，土木香内酯(Alantolactone，ALT)是土木香根茎中提取的有效成分。近年来在国内外的研究中，土木香内酯在宫颈癌、肝癌、乳腺癌，结直肠癌、脑胶质瘤的治疗中均有过明确的报道。在实验室的前期研究中也首次发现了土木香内酯可以通过氧化应激作用诱导肺癌A549细胞凋亡，但需要使用大剂量才能完全诱导A549细胞凋亡，剂量需达到40μM。于是，在进一步的研究中力求探索一种同样具有对细胞造成氧化损伤的药物与土木香内酯共同应用以加强土木香内酯的抗肺癌作用。 二酰胺(Diamide)是一种巯基氧化剂，国内外研究以明确报道它能特异性地氧化还原型谷胱甘肽(GSH)，降低细胞内GSH过氧化物酶活性，引发细胞内的过氧化损伤。但单独应用二酰胺对细胞造成氧化损伤的IC50浓度需达到2mM。 综上所述，本实验主要探索二酰胺是否可以通过诱发细胞内氧化损伤作用，在与土木香内酯共同应用时加强土木香内酯诱导肺癌A549细胞凋亡的效应，且两种药物都不用使用较大剂量就可以达到很好的诱导凋亡作用，为临床肺癌化疗提供新的用药策略。 方法:1、体外培养非小细胞肺癌A549细胞。2、MTT实验检测二酰胺与土木香内酯共同用药时A549细胞的增殖能力。3、光学显微镜观察二酰胺与土木香内酯共同用药时A549细胞的形态变化。4、细胞生存死亡形成实验(Live/dead assay)检测二酰胺与土木香内酯共同用药时A549细胞的死亡比例。5、Hoeshst33258凋亡细胞核染色实验检测二酰胺与土木香内酯共同用药时A549细胞的凋亡数量。6、流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测二酰胺与土木香内酯共同用药时A549细胞的凋亡比例。7、细胞内活性氧(ROS)检测试剂盒检测二酰胺与土木香内酯共同用药时A549细胞的活性氧生成量。8、细胞内线粒体膜电位(MMP)检测试剂盒检测二酰胺与土木香内酯共同用药时A549细胞的线粒体膜电位。9、细胞内还原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)检测试剂盒检测二酰胺与土木香内酯共同用药时A549细胞的还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽以及GSSG/GSH的比值。10、Western blotting法检测二酰胺与土木香内酯共同用药时A549细胞的STAT3信号通路相关蛋白STATA3、P-STAT3、SHP-1、Bax、Bcl-2、Cl-caspase-3、CI-PARP、JAK2、P-JAK2、PTEN等的表达。 结果:1、MTT结果显示二酰胺增强土木香内酯抑制A549细胞增殖的作用。2、光学显微镜观察到:与对照组相比，二酰胺增强土木香内酯对A549细胞的形态改变。3、细胞生存死亡形成实验、流式细胞术实验、.Hoeshst33258凋亡细胞核染色实验证实二酰胺增强土木香内酯诱导A549细胞凋亡比例。4、细胞内活性氧检测试剂盒、细胞内线粒体膜电位检测试剂盒、细胞内GSH和GSSG检测试剂盒检测结果表明:与对照组相比，二酰胺增强土木香内酯对A549细胞内活性氧生成的提升，线粒体膜电位的降低，GSSG/GSH比例的明显升高。5、Western blotting结果表明二酰胺增强土木香内酯抑制A549细胞内STATA3信号通路的激活的作用。 结论:本实验结果证明二酰胺通过诱导细胞内氧化应激作用加强了土木香内酯的抗肺癌作用，在两种药物低剂量分别应用均不能显著损伤A549的情况下，共同用药下二酰胺显著增强土木香内酯的诱导A549细胞凋亡作用。