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第一部分HBV S编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定目的:通过针对乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)S编码链富含嘌呤区366-380 nt位点设计合成锁核酸(locked nucleic acid,LNA)片段,以HBV转基因小鼠为研究对象,筛选出最佳给药剂量、给药途径和给药方式。方法:(1)实验设给药剂量组(0.0μg/g、0.1μg/g、0.2μg/g、0.3μg/g和0.5μg/g)、给药途径组(静脉注射、皮下注射和腹腔注射)和给药方式组(一次性给药、1次/2天和1次/天)。(2)利用RNA structure软件设计合成互补于HBV S编码链富含嘌呤区366-380 nt的LNA片段,以阳离子脂质体介导转染HBV转基因小鼠。(3)采用单链特异性核酸内切酶实验鉴定LNA片段稳定性,ELISA法检测小鼠血清HBsAg含量,荧光定量PCR检测血清HBV DNA含量。结果:(1)酶切实验结果显示,LNA抗核酸酶降解能力较其他寡核苷酸强。(2)给药剂量筛选实验发现,0.2μg/g剂量时LNA对HBsAg和HBV DNA表达的抑制率最高,第3、5和7 d HBsAg的平均抑制率分别为30.47%、43.67%和58.37%,HBV DNA的平均抑制率分别为31.82%、48.69%和63.34%。(3)给药途径筛选实验发现,静脉注射时LNA对HBsAg和HBV DNA表达的抑制率最高,第3、5、7 d HBsAg的平均抑制率分别为30.92%、45.78%和55.02%,HBV DNA的平均抑制率分别为33.63%、50.79%和58.99%。(4)给药方式筛选实验发现,1次/2天时LNA对HBsAg和HBV DNA表达的抑制率最高,第3、5、7 d HBsAg的平均抑制率分别为31.95%、41.08%和50.62%,HBV DNA的平均抑制率分别为33.84%、51.89%和56.12%。结论:(1)S编码链富含嘌呤区366-380 nt位点是乙肝基因治疗有效靶点。(2)LNA稳定性较其他寡核苷酸强。(3)采用静脉注射、隔天给药1次(1次/2天)、剂量为0.2μg/g体重时,LNA对HBsAg和HBV DNA表达的抑制率最高。第二部分锁核酸在转基因小鼠体内抗病毒效果研究目的:探讨针对HBV S编码链的反基因LNA在转基因小鼠体内的抗病毒效果。方法:(1)将30只HBV转基因小鼠随机分为空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义LNA组和反基因LNA组。(2)拉米夫定组采用灌胃法,空白组、无关序列组、反义LNA组、反基因LNA组采用静脉注射法。(3)给药后经眶静脉采血并分离血清,采用ELISA法检测小鼠血清中的HBs Ag含量,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA含量,RT-PCR法检测肝肝脏HBV S m RNA含量,免疫组织化学检测肝细胞HBs Ag含量;HE染色观察反基因LNA对肝肾细胞结构变化。结果:(1)给药后第1、3、5、7和14 d,反义LNA组血清HBs Ag平均抑制率分别为11.06%、26.55%、35.40%、42.48%和14.16%,HBV DNA平均抑制率分别为16.76%、35.31%、47.47%、45.29%和21.37%,与对照组(空白组、无关序列组、拉米夫定组)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)反基因LNA组血清HBs Ag平均抑制率分别为17.24%、30.17%、43.53%、57.76%和21.12%,对HBV DNA复制的平均抑制率分别为16.52%、37.18%、50.27%、61.46%和28.79%,与反义LNA组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)反基因LNA组HBV S基因m RNA的相对表达量为0.33、肝细胞HBs Ag阳性细胞率为31%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)肝肾生物化学指标检查和HE染色观察未发现异常改变。结论:针对HBV S编码链富含嘌呤区366-380 nt位点的反基因LNA在转基因小鼠体内有较好的抗病毒效果,且无明显毒副作用,为乙肝基因治疗提供理论依据和实验依据。