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雄激素可以促进多种疾病的发生发展,大量临床及流行病学资料显示,男性比女性更易感染细菌、病毒、寄生虫等病原微生物,其具体机制不详,可能与雄激素抑制机体免疫有关.黑热病是由杜氏利什曼原虫引起的一种致死性寄生虫病,杜氏利什曼原虫寄生于宿主的巨噬细胞中,从而引起一系列的单核巨噬细胞系统的病变.阐明雄激素在黑热病中的作用机制将为疾病的预防和治疗起重要的指导作用,我们在体外分离培养杜氏利什曼原虫和骨髓巨噬细胞,试图从分子水平探索雄激素对杜氏利什曼原虫细胞内感染的调控机理.
本实验使用L929细胞条件培养基作为巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-cloning stimulatory factor,M-CSF)来源,诱导小鼠骨髓细胞向巨噬细胞分化.原代培养5天后,利用荧光标记的巨噬细胞特异性F4/80抗体,通过流式细胞仪对培养体系中巨噬细胞的纯度进行分析,同时分选出F4/80抗原呈阳性表达的细胞,此即为骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs).首先用.Annexin V-FITC/PI双染法观察不同处理时间睾酮对巨噬细胞活性的影响.然后提取巨噬细胞的总蛋白,利用Western blotting方法分析睾酮处理组和杜氏利什曼原虫感染组巨噬细胞中ERK1/2、p38MAPK和JNK/SAPK基因的激活状况,并用特异性MAPK(有丝分裂原激活蛋白激酶)抑制剂进一步检测MAPK信号途径在杜氏利什曼原虫感染巨噬细胞中的可能作用.为探讨雄激素在巨噬细胞中的作用机制,采用RT-PCR、Western blotting、FCM和CLSM等方法检测巨噬细胞中是否有雄激素受体的表达,同时观察不能自由透过细胞膜的testosterone-BSA(T-BSA)分子在巨噬细胞膜表面的结合状况,最后测定巨噬细胞中游离钙离子浓度.
实验发现,雄激素可以诱导骨髓巨噬细胞凋亡,并伴有Fas,FasL和Caspase-8凋亡相关基因的表达增加,我们推测雄激素是通过:Fas/FasL途径诱导骨髓巨噬细胞凋亡的.而感染了杜氏利什曼原虫后的细胞凋亡数则明显减少,凋亡在寄生虫和宿主相互作用中具有重要意义,寄生虫会因抑制宿主细胞发生凋亡而达到维持感染和虫荷的目的.
性激素对靶细胞的作用可以通过两种不同途径来实现:一种是经典途径即基因组途径,性激素通过自由扩散进入胞浆并与相应受体结合,活化的受体二聚体与HRE特异结合,启动下游相关基因转录;另一种途径是近几年来逐渐引起人们关注的非基因组效应,其特点是作用快,不需进入细胞即可起效,随后也可由于细胞的内吞作用而进入胞内.本研究采用多种方法试图在巨噬细胞中寻找雄激素的受体,包括RT-PCR、Western-blotting、FCM以及CLSM等,然而,这些方法都不能提供有说服力的证据说明巨噬细胞中存在雄激素的细胞内受体,很显然,雄激素在巨噬细胞中的作用机理不能够用传统的激素.细胞内受体模式来解释.相反,使用不能通过细胞膜的雄激素-BSA,我们发现巨噬细胞的表面存在有睾酮的结合位点,并且激素结合以后能迅速引起巨噬细胞内游离钙离子浓度增加,细胞内钙离子的增加主要是由细胞外钙离子内流而不是细胞内钙离子释放引起的.
我们发现雄激素可以增加杜氏利什曼原虫对巨噬细胞的感染率与感染水平.寄生虫对宿主细胞正常信号传导途径的干扰是其在胞内生存的必要条件,蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式,几乎涉及所有的生理及病理过程.MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,由于其性质的保守性和分布的广泛性,在信号传导过程中占有极其重要的地位.大量实验室证据表明,病原体感染可以干扰宿主细胞的MAPK信号途径.在本实验中,杜氏利什曼原虫感染快速、可逆的激活了骨髓巨噬细胞的p38 MAPK信号分子,而对MAPK家族的ERK1/2和JNK/SAPK活性并没有影响.我们进一步发现,雄激素本身对MAPK信号分子的活性没有影响,有趣的是,雄激素却可以抑制杜氏利什曼原虫对p38 MAPK的激活作用.使用p38 MAPK抑制剂SB203580可以抑制杜氏利什曼原虫对p38 MAPK的激活作用,并进一步发现SB203580亦可增加杜氏利什曼原虫对巨噬细胞的感染率,说明p38MAPK信号途径在杜氏利什曼原虫感染杜氏利什曼原虫中起重要作用.
睾酮可诱导胞内钙离子增加,而钙离子是一种重要的信号分子,可启动一系列信号传导途径调节转录因子的活性,其在细胞内水平的高低影响许多细胞功能.我们预先用钙鳌合剂BAPTA处理细胞,再加入睾酮和杜氏利什曼原虫,发现在BAPTA处理组中,睾酮不能抑制杜氏利什曼原虫p38 MAPK的激活作用,表明其抑制作用是由钙离子介导的.
根据非基因组效应的特点和骨髓巨噬细胞内未检测到雄激素经典胞内受体的实验结果,我们推测,雄激素增加了杜氏利什曼原虫对巨噬细胞的感染,其启动过程可能与雄激素膜受体途径有关.雄激素通过膜受体途径抑制了杜氏利什曼原虫对宿主细胞p38 MAPK的激活作用,进而增加了原虫的感染.膜受体途径为我们进一步探讨雄激素如何发挥其对免疫系统的抑制作用,雄激素与黑热病间的关系,以及阐述类固醇激素的分子作用机理及其基因调控具有十分重要的意义.