【摘 要】
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染料荧光团SYTO 9和碘化丙啶(PI)广泛应用于医药,食品工业和环境监测领域,用来评估细菌的生存能力。然而,这些染料的测定结果是否能准确代表细菌真实活性,染色条件和应用条件的影响是不确切的。本论文选择典型的革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)和革兰氏阳性菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis),通过考察染料的染色动力学特性、染料对细菌的生理、形态影响,研究S
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染料荧光团SYTO 9和碘化丙啶(PI)广泛应用于医药,食品工业和环境监测领域,用来评估细菌的生存能力。然而,这些染料的测定结果是否能准确代表细菌真实活性,染色条件和应用条件的影响是不确切的。本论文选择典型的革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)和革兰氏阳性菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis),通过考察染料的染色动力学特性、染料对细菌的生理、形态影响,研究SYTO 9和PI的细菌染色特性、染料对细胞的潜在毒性研究,并优化染色条件,以期为采用流式细胞术,应用SYTO 9和PI作为染料准确评估细菌活性提供基础数据支撑。得出主要研究结果如下:由于两类菌体的细胞壁结构差异,导致单染效果不同。SYTO 9可以立即穿透B.brevis的细胞壁和细胞膜与核酸结合,而E.coli细菌细胞经过EDTA透化处理后才能充分染色SYTO 9并与核酸结合速度较慢,在20 min后达到稳定。相反,PI进入B.brevis需要消耗时间,而PI与E.coli体内核酸结合速度非常快。SYTO 9和PI信号均受荧光共振能量转移和背景荧光的影响,两种染料与核酸之间稳定的结合和释放过程有利于获得准确的结果。基于最大化的信噪比,10~6cells/m L B.brevis和E.coli细胞丰度下,最佳的染色浓度都为2.5μM SYTO 9和9.0μM PI,并且在室温下分别孵育10 min和20 min。导数光谱法研究SYTO 9和PI染色动力学特性的结果表明,染料对两类菌体的双重染色特性一致。SYTO 9在双重染色中直接进入细胞,而由于静电力作用PI在进入细胞之前倾向于粘附在细胞壁上。过量染料染色对细胞的潜在毒性研究表明,过量的SYTO 9改变了磷脂合成,表现为棕榈酸C16:0和硬脂酸C18:0的增加和不饱和脂肪酸比例上升,通过改变膜的通透性促进了PI染料的进入,导致错误的结果;而过量的PI使细菌基本结构特征受到不可逆的破坏。
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