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近年来的研究报道显示嗜酸氧化亚铁硫杆菌(以下简称A.f)petⅡ操纵子编码的cycA-2等6个蛋白可能参与该菌的硫氧化代谢。我们前期已鉴定出该操纵子的启动子-35区和-10区两个核心元件。从Genbank中已公布的A.f模式菌ATCC23270的全基因组序列中,我们发现该操纵子启动区上游的AFE2726基因,其编码蛋白功能未知。
将携带有AFE2726基因及petⅡ操纵子启动区的β-半乳糖苷酶报告基因重组载体pSV72导入E.coli DH5α进行检测,结果显示:在培养基中加入Na2S2O3(一种A.f菌可利用的可溶能源基质),使β-半乳糖苷酶的活性增加35.66%,表明Na2S2O3对该操纵子调控单元具有诱导增强作用。
为了考察AFE2726基因编码蛋白是否与Na2S2O3对petⅡ操纵子的诱导作用有关,采用定点突变技术,将pSV72中AFE2726基因的起始密码子突变,使该蛋白不能表达。将突变型载体pSV72-AFE2726m导入大肠杆菌后发现,其β-半乳糖苷酶活性不再受Na2S2O3的影响,表明AFE2726基因编码蛋白参与petⅡ操纵子启动区对Na2S2O3的响应。
将AFE2726基因亚克隆至pLM1载体中,导入E.coli BL21进行表达及纯化,获得重组蛋白,经电泳迁移率检测(EMSA)证实该蛋白能与petⅡ操纵子启动区DNA片段特异性结合,确证了该蛋白是petⅡ操纵子的调节蛋白。
对AFE2726基因编码蛋白进行生物信息学分析,发现其肽链中包含Cys62和Cys72两个残基,而Cys的巯基可能与Na2S2O3结合,导致蛋白构象发生改变而丧失对启动子的结合能力。因此,我们分别对上述两个残基进行突变,报告基因检测表明:Cys62的突变对该调节蛋白的功能影响不大;而Cys72的突变则完全消除了该调节蛋白对Na2S2O3的响应。
综上所述,我们得出以下结论:A.f菌petⅡ操纵子参与该菌的硫氧化代谢,AFE2726基因编码蛋白是该操纵子的调节蛋白,其中的Cys72残基是该调节蛋白与Na2S2O3的关键结合位点。