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骨肉瘤是一种恶性结缔组织肿瘤,恶性程度甚高,预后极差,特点是肺部转移早,在临床做出骨肉瘤的诊断时,其中大部分患者已经发生了肺的微小转移。寻找和验证新的在骨肉瘤转移相关基因对揭示骨肉瘤的分子转移机制有重要意义,可能为骨肉瘤转移的治疗提供新思路。Sirtl是哺乳动物Sirtuin蛋白家族的重要一员,可以与染色质、许多重要的转录因子及转录共调控因子相互作用,参与代谢、衰老、肿瘤发生发展等一系列病理生理过程。根据相关文献及前期实验结果,Sirtl具备作为骨肉瘤转移预测生物标记物的可能性,其与骨肉瘤发生发展的关系需要深入研究。本研究将通过病例回顾分析探讨Sirtl与骨肉瘤转移及预后的相关性；通过实验明确Sirtl对骨肉瘤转移及化疗敏感性的影响；采用表达谱芯片技术筛选Sirtl基因调控的关键基因,同时与参与金丝桃苷抑制骨肉瘤生长分化的关键基因进行比较,提示与骨肉瘤转移相关的可能分子调控机制。研究步骤1. Sirtl在骨肉瘤中的表达与肿瘤转移及预后相关性探讨①对33例骨肉瘤患者进行三年随访,统计患者生存、死亡、复发、转移情况与患者骨肉瘤Sirtl表达水平的相关性；②免疫组化检测22对骨肉瘤及正常组织中Sirtl蛋白表达水平。2. Sirtl在骨肉瘤中的表达及对骨肉瘤的生物学行为的影响①构建7株骨肉瘤原代细胞系；②Western blot检测7种骨肉瘤原代细胞株中的Sirtl的表达；③Transwell和划痕实验研究Sirtl对骨肉瘤细胞迁移的影响,及siRNA沉默Sirtl后骨肉瘤细胞迁移能力的变化；④SRB法研究骨肉瘤原代细胞株中,Sirtl与化疗药ADR药物敏感性之间的关系。3.Sirtl调控骨肉瘤转移可能机制及与金丝桃苷共同作用可能性的研究①利用基因表达谱芯片技术筛选Sirtl调控的靶基因；②MTS实验观察金丝桃苷对骨肉瘤细胞增殖的影响；采用流式细胞仪分析金丝桃苷对骨肉瘤细胞凋亡和细胞周期的影响；③采用表达谱芯片技术筛选参与金丝桃苷抑制骨肉瘤生长分化的关键基因,并与Sirtl下游调控基因进行比较分析。研究结果1.Sirtl与骨肉瘤发生转移存在相关性①Sirtl在骨肉瘤患者肿瘤组织中的表达高于癌旁组织(p<0.01)；②Sirtl表达水平与患者转移呈正相关(p<0.01)2.Sirtl在骨肉瘤转移中具有重要作用①Sirtl蛋白表达水平在骨肉瘤各原代细胞系中呈差异表达(p<0.01)；②沉默表达Sirtl能明显抑制骨肉瘤原代细胞的迁移能力(p<0.01)；③Sirtl的表达与ADR药物的敏感性没有直接关系(p>0.01)。3.Sirtl调控多个重要基因,并与抑制骨肉瘤生长分化的药物金丝桃苷可能具有部分共同的肿瘤调控机制①筛选到Sirtl的下游调控基因：2662个上调和613个下调基因。这些基因主要参与细胞增殖、凋亡和侵袭等重要细胞生物学功能,其中EMT通路特征蛋白E.cadherin编码基因CDH1在Sirtl基因沉默后,表达明显上调。②金丝桃苷能明显抑制骨肉瘤细胞株U20S和MG63的增殖(p<0.01),诱导细胞G0/G1期阻滞(p<0.01)；③筛选金丝桃苷调控基因：得到3572个上调和2848个下调基因,其与Sirtl存在共同的调控基因：661个上调和429个下调基因。研究结论①患者骨肉瘤组织Sirtl表达分析及3年随访调查提示,Sirtl在骨肉瘤组织中表达显著上调,与患者转移呈正相关。②细胞实验证实Sirtl在骨肉瘤中存在显著差异表达,沉默Sirtl能抑制骨肉瘤迁移。Sirtl可能在骨肉瘤转移中具有重要作用。③筛选至④Sirtl调控的系列下游基因,这些基因参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学过程。并发现与骨肉瘤生长分化抑制药物金丝桃苷可能具有部分共同的调控机制。Sirtl在骨肉瘤转移中的作用,可能与EMT通路相关。