【摘 要】
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常规的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统已广泛应用,虽已积累大量经验,但也存在不足之处,如菌株生长速度慢、密度不高、外源蛋白的表达和翻译后加工都不够理想.巴
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常规的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统已广泛应用,虽已积累大量经验,但也存在不足之处,如菌株生长速度慢、密度不高、外源蛋白的表达和翻译后加工都不够理想.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统,近年来已受到广泛重视,是一种非常具有潜力的真核表达系统.此系统不但能克服酿酒酵母表达系统的不足,而且具有高分泌、高稳定和高表达三大显著特点,外源蛋白的表达水平也比酿酒酵母高.该论文的研究使用基因重组技术表达纤维素外切酶CBH I,构建了在毕赤酵母细胞中表达的重组质粒pPIC9k-cbhl,转化嗜甲醇酵母并进行表达实验研究.根据目的的基因cbhl的cDNA序列设计两条引物,使上游带SnaB I酶切位点,下游带Avr Ⅱ酶切位点,以质粒pUCmT-cbhl为模板,进行PCR扩增反应;将所得的DNA片段经SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ双酶切后与载体pPIC9k质粒进行连接,然后导入大肠杆菌JM109,用Amp筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组质粒pPIC9k-cbhl.再用电穿孔法转化酵母(Pichia pastoris),用缺组氨酸的MD平板筛选阳性菌株,通过甲醇诱导表达.该论文用所设计的引物扩增出了两端分别带SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ酶切位点的cbhl DNA片段,插入载体pPIC9k并导入大肠杆菌JM109获得了阳性克隆,经双酶切鉴定表明重组质粒是pPIC9k-cbhl,说明目的基因cbhl已成功克隆到载体pPIC9k上.转化嗜甲醇酵母获得重组的毕赤酵母菌株,并诱导其分泌表达目的蛋白,发现甲醇浓度为0.5﹪、连续诱导3天得到的蛋白表达量较高.经SDS-PAGE电泳得到56kD的重组蛋白条带;而且,表达的CBH I可以分解底物pNPC,但对羧甲基纤维素(CMC)不产生作用.实验结果表明我们构建的重组质粒pPIC9k-cbhl已经在嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)中获得了表达.在上述研究的基础上,该论文试图通过点突变对CBH I的糖基化位点进行改造,构建点突变重组质粒,转化毕赤酵母,研究过度糖基化对纤维素外切酶CBH I在酵母中表达的影响.
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