论文部分内容阅读
本文主要从以下几部分进行论述： 第一部分 La蛋白新型抑制剂H11调控乙肝病毒的miRNA表达谱变化 目的:La蛋白作为RNA分子伴侣,能够稳定乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的结构,保护HBV复制.La蛋白新型抑制剂HBSC11是一种吡唑[1,5-a]并吡啶-2-甲酸甲酯化合物(简称H11).我们前期研究结果表明La蛋白新型抑制剂H11能够显著抑制肝癌细胞HepG2.2.15内人La蛋白的表达量,从而下调乙肝病毒的复制水平和抗原表达水平.然而H11抑制乙肝病毒的分子机制尚不清除,本研究希望筛选和鉴定出几种在H11抗乙肝病毒感染中起关键调控作用的微小RNA(microRNA,miRNA),进一步探索抗乙肝病毒化合物H11调控乙肝病毒复制的作用机制. 方法:HepG2.2.15肝癌细胞具有完整的HBV基因组,能够稳定表达HBV DNA和乙肝抗原.本研究分别用DMEM和H11处理HepG2.2.15作为对照组和实验组,提取对照组和实验组的总RNA,利用miRNA芯片进行miRNA芯片分析,获取差异表达的miRNA,并采用实时定量荧光PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术对差异表达的miRNA进行验证.对差异的miRNA进行靶基因预测,同时对靶基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析. 结果:miRNA芯片结果发现hsa-miR-3912-5p、hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-7159-5p这三种miRNA在H11处理的HepG2.2.15细胞中表达显著上调.qRT-PCR结果和miRNA芯片结果基本一致,miRNA芯片结果可信.生物学信息分析表明miRNA预测的3184个靶基因主要参与基因转录和表达、磷酸化调节等过程,同时富集在转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)、wnt和p53等与HBV感染调控相关以及肝癌发生发展的重要信号通路中. 结论:hsa-miR-3912-5p、hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-7159-5p以及潜在的调控通路(TGF-β、wnt、p53)很可能参与了H11介导的抑制乙肝病毒复制过程. 第二部分 La蛋白新型抑制剂H11调控乙肝病毒的lncRNA表达谱变化 目的:在乙型肝炎病毒作用机制的前期研究中,我们发现La蛋白新型抑制剂H11,能通过抑制人La蛋白和HBV RNA的结合从而抑制HBV的复制.然而这一过程尚不清楚.本研究希望进一步探索抗乙肝病毒化合物H11抑制乙肝病毒复制的作用机制. 方法:我们在稳定转染HBV的肝癌细胞HepG2.2.15中,用化合物H11处理和不处理作为实验组和对照组.采用Agilent Human(4*180K)长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)芯片进行高通量分析筛选.差异表达的lncRNA和mRNA采用GO和pathway分析其可能参与的生物学进程和相关作用通路.构建差异表达的mRNA和lncRNA共表达关系网络图.根据生物信息学结果筛选出表达异常并具有研究价值的lncRNA和mRNA采用qRT-PCR方法进一步验证其在细胞中的表达. 结果:芯片数据显示经H11处理后的实验组相比于对照组有61个lncRNA上调,74个lncRNA下调,mRNA中有43个上调,44个下调,这些结果与qRT-PCR结果一致.GO和pathway分析结果表明,差异表达的lncRNA参与调节病毒基因复制、RNA转录后的基因沉默、以及JAK-STAT信号通路和凋亡通路.GO分析显示差异的mRNA富集于负向调控Wnt通路和细胞生长通路.Pathway分析显示差异表达的mRNA富集于基因转录靶点、核β-连环蛋白(β-catenin)信号通路、P53的直接作用因子、过氧化物酶增生激活受体通路(peroxisome proliferator-activated receptors signalling,PPAR)和过氧化物酶通路.差异表达的lncRNA-mRNA共表达网络中有96个节点基因,包括51个lncRNA和45个mRNA,585对lncRNA-lncRNA,mRNA-mRNA和lncRNA-mRNA相互关系,其中有322对正相关,263对负相关. 结论:La蛋白靶向抑制剂H11通过调控PPAR信号通路、p53通路、以及wnt/β-连环蛋白通路中关键的mRNA和lncRNA抑制乙肝病毒复制. 第三部分 La蛋白在肝癌细胞和肝癌组织中的表达和意义 目的:La蛋白是一种RNA结合蛋白,作为RNA分子伴侣,参与RNA的代谢以及促进某些肿瘤细胞的生长.然而La在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中的作用尚不明确,此部分研究的目的是明确La在肝癌细胞和肝癌组织中的表达情况. 方法:采用qRT-PCR和蛋白质免疫印迹(western blot,WB)技术检测La mRNA和La蛋白在8个肝癌肝细胞和正常肝细胞的表达水平,进一步在肝癌组织和对应的癌旁组织中明确La mRNA和La蛋白的表达情况,并结合公共数据库资料综合分析,明确肝癌组织中La的表达情况. 结果:与正常肝细胞相比,La mRNA在8株肝癌细胞中的表达均偏高,其中在HepG2、HepG2.2.15、Hu7、SMCC-7721、SK-Hep-1、MHCC-97H肝癌细胞中表达明显偏高,差异具有统计学意义(P<0.5).在LM3和MHCC-97L中的表达稍微偏低.临床样本组织结果显示,La mRNA在70%(21/30)的肝癌组织中表达高于对应的癌旁组织,P<0.05,差异倍数在1.5倍以上的约占56.7%(17/30),这一结果和公共数据库中基因芯片的结果一致.12对肝癌组织western Blot结果表明,La在肝癌组织中的蛋白表达水平均也明显高于对应的癌旁组织(P<0.01). 结论:La在HCC细胞和组织中的转录水平和翻译水平均表达增加.La蛋白或可成为肝细胞肝癌治疗的潜在靶点.