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[研究目的及背景]阿霉素(Adriamycin,多柔比星)是于20世纪60年代初在可产色素链霉菌属细菌中最先分离到的一类葸环类抗生素。直到今天,葸环类抗生素仍然是抗肿瘤药物中最有效的一类,在癌症化疗中占有重要的地位。阿霉素被广泛应用于肿瘤性疾病的治疗,比如在膀胱,乳腺,肝,肺,卵巢,胰腺,前列腺,甲状腺,子宫等发生的癌症中的治疗,而且阿霉素几乎是所有淋巴瘤化疗方案中的一线药物。阿霉素对肿瘤细胞的作用机制可能包括嵌入DNA,抑制生物大分子的合成；DNA交联；DNA结合以及烷化；通过抑制拓扑异构酶Ⅱ引发DNA损伤；直接的膜效应等等。但是,阿霉素又是一把双刃剑,它的应用同时会导致心肌病的发生,甚而进展至充血性心力衰竭,这时普通药物治疗往往难以奏效。而且,随着阿霉素临床应用剂量的增大以及和其他药物的合用,引发心肌症的概率也大大提高。阿霉素所致心肌病的机制仍然不是很清楚,目前有以下几个假说来阐释阿霉素性心肌损伤的机理：(1)离子和自由基机制：该假说认为氧化应激的增强以及抗氧化剂的缺乏可能在心肌病和心力衰竭的发生中是个重要的角色。(2)代谢机制：蒽环类抗生素酒精代谢产物能影响心肌能量代谢、离子梯度及钙的转运,所有这些变化均会损伤心肌的收缩和舒张功能。(3)“联合”假说：以上两种机制可能循序发生并且协同作用促发心肌损伤。(4)凋亡机制：心肌细胞凋亡在促发阿霉素所致心肌病中的关键性作用已经越来越被人们所认识。上述假说中胞内的各种改变以及过多过氧化氢的产生都会引发细胞凋亡。因此,拮抗心肌细胞的凋亡是预防及治疗阿霉素性心肌病的重要的方法。凋亡的发生有赖于凋亡蛋白酶(caspases)的激活。两个主要激活caspases的途径是：(Ⅰ)由细胞表面受体Fas、FADD蛋白以及后续激活的起始凋亡蛋白酶(比如caspase-8)所形成的凋亡引发信号复合物而介导的外源性信号途径(死亡受体介导的凋亡信号途径)；(Ⅱ)线粒体细胞色素c释放后通过形成由凋亡激活因子(Apaf-1)、细胞色素c和caspase-9前体组成的凋亡小体复合物从而激活caspase-9的内源性途径(线粒体途径)。所有的这些假说都与阿霉素抗肿瘤的作用机理不甚相同,这就给我们在设计不减少药物抗肿瘤活性的同时还能保护心脏的治疗方案中提供了希望。因此,人们尝试了很多方法来预防阿霉素的心肌毒性,包括使用阿霉素的类似物,阿霉素药剂的微脂粒包裹,抗氧化剂以及离子螯合药物右雷佐生(dexrazoxane)的使用等等。但是迄今为止,所有这些保护方案的使用都有所限制,不甚完美。所以,寻找更佳的解决该化疗药心肌毒性的方法成为亟待解决的问题。VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor,血管内皮生长因子)是血小板源性生长因子家族中的一个亚家族,在胚胎及后天发育中,广泛参与血管发生、血管再生及淋巴管生成。在1989年,基于对未知的血管再生和血管渗透性因子的先驱性研究,人们最先克隆出了VEGF-A(又被叫做VEGF)。之后,VEGF被陆续发现参与很多功能调节,比如软骨内骨形成,组织再生,造血干细胞存活以及一些病理性过程包括肿瘤性或者炎症性疾病。因选择性剪接VEGF有很多异体同工型,其中VEGF165(即在信号序列外有165个残基)是表达最多的一种。VEGF家族通过它们的受体(VEGFRs)来刺激细胞的反应,有很多证据表明VEGFR-2 (KDR/Flk)可介导几乎所有已知的细胞对VEGF的反应。VEGFR-2在细胞内先被翻译为150 kDa的蛋白,然后经过一系列糖基化的加工,成为230 kDa形式并于细胞表面表达。我们先前的实验已经证明VEGF165能有效减轻氧化应激所致心肌细胞的凋亡。同样也有报道分别证实在左室肥大或者急性心肌梗塞模型中,于心包内注射重组VEGF蛋白或者于心肌内注射VEGF165 cDNA均能减少心肌凋亡。有实验室在将心肌细胞与骨髓干细胞、脂肪组织来源干细胞或者间叶干细胞等干细胞共培养时,也发现由不同种类干细胞所分泌的VEGF可保护心肌细胞免受缺氧或者过氧化氢所致的凋亡。因此,我们推测VEGF165在阿霉素所致心肌细胞的凋亡中也会有保护作用。复制缺陷型腺病毒是组织和细胞有效的转基因治疗转运载体,这得益于该病毒以下几个特性：能有效进行增殖,滴度高；在增殖和非增殖细胞中均可有效感染和表达基因；不整合到染色体中,无插入致突变性等。因此,我们拟运用Ad5-VEGF来探讨VEGF保护心肌细胞免受凋亡的可能性。[研究方法]1.构建VEGF165复制缺陷型腺病毒载体,然后以20：1的感染复数(Multiplicity of Infection, MOI)转染H9c2细胞(大鼠胚胎心脏成肌细胞)。VEGF腺病毒载体转染H9c2细胞24小时后,或被直接收集用作后续实验,或再加入2μM浓度的阿霉素,使之作用于细胞24小时后再被收集。Ad5-GFP (green fluorescence protein)被用作载体对照。没有被转染腺病毒的H9c2细胞或被用作对照,或被2μM阿霉素作用24小时后被收集起用作后续试验。2.采用Western blot技术检测VEGF165目的蛋白在转染细胞的表达类型和效率。转染Ad5-VEGF16524小时后分别收集全部的大鼠胚胎心脏成肌细胞裂解物和全部的细胞培养液做免疫印迹,用抗VEGF165抗体分析目的蛋白在细胞中和细胞培养液浓缩物中的表达。VEGF受体Flk-1的抗体用来检测大鼠胚胎心脏成肌细胞和HUVEC细胞(人类脐静脉内皮细胞,阳性对照)全部细胞裂解物中的Flk-1的表达。3.使用Annexin V-FITC染色流式分析技术来检测H9c2细胞的凋亡。收集对照组,阿霉素组,Ad5-VEGF165转染组及转染Ad5-VEGF165后的阿霉素处理组的细胞,PBS冲洗后使之悬浮于Annexin V结合缓冲液中,之后用Annexin V-FITC染色并进行流式分析。4.收集所有以上四组细胞,包括对照组,阿霉素处理组,转染Ad5-GFP后的阿霉素处理组以及转染Ad5-VEGF165后的阿霉素处理组,提取胞浆蛋白,分别使用抗cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-8、FADD、Bcl-2、磷酸化Akt(p-Akt, Ser473)及总Akt (t-Akt)的抗体通过Western blot技术来检测各个凋亡相关的蛋白的表达水平。5.分别对以上四组细胞采用凝胶迁移实验(EMSA)来检测NF-κB的结合活性,后者可介导Bcl-2蛋白的表达,并受到Akt的调控。6.数据结果由均数士标准差形式来表达。使用单因素方差分析(ANOVA)及Student-Newman-Keuls检验方法来判定组与组之间的统计学差异。p值小于0.05被认为有统计学意义。[实验结果]1.H9c2细胞转染Ad5-VEGF16524小时后VEGF165蛋白以分泌型被检出。VEGF受体Flk-1也同样被检出,Flk-1的表达模式与阳性对照细胞HUVEC的表达模式相同。2.阿霉素可显著增加H9c2细胞中Annexin V染色阳性细胞(即H9c2凋亡细胞)的百分率,增加幅度为315%.而提前转染过Ad5-VEGF165的H9c2细胞再经过阿霉素处理后,与单阿霉素组相比,Annexin V染色阳性细胞的比例下降了53%.单转染Ad5-VEGF165的细胞与对照组细胞无明显统计学差异。阿霉素同时也显著增加了H9c2细胞中活化的caspase-3的表达水平,升高率为168%。Ad5-GFP与阿霉素共处理后细胞的caspase-3表达水平与单阿霉素组无异。而转染Ad5-VEGF165后再加阿霉素刺激组中caspase-3表达水平比单阿霉素组下降了33%.3.作为死亡受体介导的凋亡途径中重要的信号分子,H9c2细胞中FADD和活化的caspase-8的蛋白表达水平在阿霉素刺激后分别提高了234%和106%.而在Ad5-VEGF165+阿霉素细胞组,相比单阿霉素细胞组,FADD和活化的caspase-8的蛋白表达水平分别下降了47%和40%.载体对照Ad5-GFP+阿霉素组中FADD和活化的caspase-8的蛋白表达水平与单阿霉素组并无显著统计学差异。4. Ad5-VEGF165转染H9c2细胞后与单阿霉素组相比可显著提高Bcl-2表达水平达236%.同样,NF-κB DNA结合活性与单阿霉素组相比也升高了143%.与之一致的结果是,磷酸化的Akt水平在Ad5-VEGF165+阿霉素细胞组中也比单阿霉素组增高了153%.[结论]1.VEGF165过表达可减弱阿霉素在H9c2心肌细胞中的致凋亡作用。2.VEGF165过表达可降低阿霉素在H9c2心肌细胞中促升FADD和活化的caspase-8蛋白表达水平的作用,揭示VEGF165可通过抑制外源性凋亡信号途径来拮抗阿霉素所致的心肌细胞的凋亡。3.VEGF165过表达可在阿霉素刺激后的H9c2心肌细胞中上调Akt/NF-κB/Bcl-2促存活信号通路,表明线粒体凋亡通路也参与在VEGF165对心肌细胞凋亡的保护作用中。