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严重的失血性休克(Hemorrhagic shock, HS)通过启动固有免疫系统触发全身炎症反应综合症等,易并发急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)进而导致难以治疗的急性呼吸窘迫综合症(ARDS),在多器官功能障碍综合征的整个发病过程中居重要地位。ALI以肺血管内皮和肺泡上皮细胞广泛损伤为病理特征,其中内皮细胞损伤发生在早期环节,通过增强活性放大免疫反应,是炎症反应的重要源泉。因此,探讨失血性休克启动肺血管内皮细胞炎症反应的免疫机制,寻找新的治疗切入点显得非常重要和迫切。本课题组在过去的研究中发现败血症的起始阶段,通过激活内皮细胞Toll样受体(Toll like receptor, TLR)4介导TLR2的表达；另外来源于中性粒细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adeninedinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶产生的活性氧参与调控内皮细胞的活性；高迁移率族蛋白1(HMGB1)作为早期炎症因子参与失血性休克后机体的炎症反应和组织损伤。本研究在这些原创性发现的基础上采用Real-Time PCR、免疫共沉淀和Western blot等技术,进一步从动物和细胞水平研究TLR4、TLR2和中性粒细胞介导失血性休克活化肺血管内皮细胞的机制。第一部分：失血性休克时,TLR4继发上调内皮细胞TLR2的表达,扩大内皮细胞活性的作用及机制,并获得以下重要发现：1.失血性休克通过HMGB1调控肺组织TLR4和TLR2的表达。我们在TLR4突变小鼠、TLR2-/-敲基因小鼠和野生型小鼠失血性休克诱导急性肺损伤模型基础上,检测肺组织TLR4、TLR2的表达。结果发现失血性休克时,TLR4上调TLR2的表达。进而在失血性休克手术前体内注射HMGB1中和抗体,以研究内源性HMGB1是否参与调控TLR4/2的表达。结果表明HMGB1-TLR4上调肺组织TLR2的表达。2. HMGB1-TLR4对肺血管内皮细胞TLR2表达的影响。我们继而观察HMGB1、MyD88和NFκB对TLR4突变小鼠、TLR2-/-敲基因小鼠和野生型小鼠肺血管内皮细胞TLR4和TLR2表达的影响。结果显示HMGB1-TLR4通过MyD88-NFκB通路上调肺组织TLR2的表达。3. HMGB1参与TLR4和继发上调TLR2对失血性休克时肺组织ICAM1的影响。为明确失血性休克后TLR4和TLR2对肺组织炎症反应的影响,我们检测不同来源小鼠失血性休克早期和晚期,肺组织IRAK4、NFκB、NADPH氧化酶和细胞间粘附分子(Intercellular adhesion molecule, ICAM1)的变化。结果发现,失血性休克早期主要通过TLR4的IRAK4和NFκB途径促进肺组织ICAM-1的表达和NADPH氧化酶的活化,而晚期则通过TLR4继发上调的TLR2信号通路实现的。结合失血性休克模型前体内注射HMGB1中和抗体实验,我们发现HMGB1通过TLR4/2调控ICAM1的表达。4. HMGB1通过TLR4和继发上调TLR2影响肺血管内皮细胞NADPH氧化酶和ICAM1的表达。TLR4突变小鼠、TLR2-/-敲基因小鼠和野生型小鼠肺血管内皮细胞给予HMGB1刺激,检测内皮细胞中NADPH氧化酶的活性和ICAM1的表达。结果显示,HMGB1刺激早期通过TLR4信号通路促进NADPH氧化酶的活性和ICAM1的表达,而刺激晚期则通过TLR2信号通路进行调控。为了进一步分析细胞中NADPH氧化酶生成活性氧(ROS)的权重,细胞预先加入NADPH氧化酶抑制剂,再动态观测HMGB1刺激内皮细胞后ROS的生成。结果显示内皮细胞活性氧的来源主要是NADPH氧化酶的活化。5.TLR2上调在失血性休克诱导急性肺损伤中的意义我们在不同来源小鼠失血性休克诱导急性肺损伤模型基础上,经气道分别给予TLR4的激动剂(脂多糖)和TLR2的激动剂(肽聚糖),测定肺泡灌洗液中的中性粒细胞数目,并检测肺组织IRAK4、NFκB的表达和NADPH氧化酶活性的差异。结果表明失血性休克晚期,肽聚糖通过激活TLR2通路促进中性粒细胞依赖ICAM1粘附肺血管内皮细胞,促进炎症反应。第二部分：研究中性粒细胞NADPH氧化酶产生的活性氧对失血性休克活化内皮细胞NADPH氧化酶的作用及机制,并获得以下重要发现：1.失血性休克对肺组织和中性粒细胞NADPH氧化酶的影响。为了明确失血性休克对肺组织NADPH氧化酶的作用,我们检测TLR4突变小鼠和野生型小鼠失血性休克后,肺组织和中性粒细胞NADPH氧化酶的活化程度。结果显示,失血性休克通过HMGB1-TLR4激活肺组织和中性粒细胞NADPH氧化酶。2.失血性休克时,中性粒细胞对肺组织NADPH氧化酶活性的影响。我们在去除中性粒细胞小鼠模型的基础上再行失血性休克,小鼠复苏时补充经过失血性休克刺激的中性粒细胞(分别来自于gp91-/-敲基因小鼠和野生型小鼠),检测肺组织NADPH氧化酶的活性。结果发现,失血性休克激活的中性粒细胞NADPH氧化酶促进肺组织NADPH氧化酶的活化。3.中性粒细胞对肺血管内皮细胞NADPH氧化酶活性的影响。将gp91-/-敲基因小鼠和野生型小鼠肺血管内皮细胞与gp91-/-或野生型小鼠的中性粒细胞共培养,并给予HMGB1刺激,检测内皮细胞中NADPH氧化酶的活性。结果显示,HMGB1和中性粒细胞NADPH氧化酶产生的活性氧促进内皮细胞NADPH氧化酶的活化。4. Rac1、p38MAPK信号转导通路参与HMGB1激活内皮细胞的NADPH氧化酶。用Rac1、Akt和p38有丝分裂原激活蛋白激酶抑制剂刺激肺血管内皮细胞,随后给予HMGB1。检测血管内皮细胞NADPH氧化酶的活性。结果发现,Rac1和p38MAPK抑制剂显著下调HMGB1诱导肺血管内皮细胞中NADPH氧化酶的活性。5.Rac1信号转导通路参与HMGB1和活性氧增强内皮细胞NADPH氧化酶的活性。用Rac1、Akt和p38有丝分裂原激活蛋白激酶抑制剂刺激肺血管内皮细胞,随后给予HMGB1伴有H202共孵育。检测血管内皮细胞NADPH氧化酶的活性。结果发现,只有Rac1抑制剂能够降低肺血管内皮细胞中NADPH氧化酶的活性。综上所述,我们获得以下结论：1.失血性休克时,HMGB1通过TLR4-MyD88-NFκB通路调控肺血管内皮细胞TLR2的表达。2.失血性休克不同时期,HMGB1促进肺组织IRAK4、NFκB、NADPH氧化酶活性和ICAM1的表达依次依赖于TLR4和TLR2通路。3.TLR4继发上调的TLR2扩大了肺组织识别外源性刺激物的范围,延长了肺损伤的时程和加重损伤的程度。4.失血性休克通过HMGB1-TLR4活化肺组织和中性粒细胞NADPH氧化酶。5.失血性休克激活的中性粒细胞通过活化自身NADPH氧化酶促进肺组织和肺血管内皮细胞NADPH氧化酶的活性。6. HMGB1活化内皮细胞涉及到Rac1和p38MAPK信号通路；而伴有活性氧增强肺血管内皮细胞NADPH氧化酶的过程仅有Rac1通路。本研究发现了失血性休克继发急性肺损伤时,通过肺血管内皮细胞TLR4与TLR2受体交叉对话以及中性粒细胞和血管内皮细胞之间相互作用,提高肺血管内皮细胞炎症反应的活性,从而促进急性肺损伤的发生发展,成为介导肺组织炎症和损伤的重要发病机制之一。该研究为寻找新的急性肺损伤治疗途径提供分子基础和理论依据。