论文部分内容阅读
百合具有独特的观赏与利用价值，其广阔的市场需求与发展前景，带动了全球百合育种工作的开展。目前，国际花卉市场每年培育出数百种百合新品种，而中国作为世界百合植物的分布中心，其育种工作仍处于起步阶段，缺乏具有自主知识产权的百合新品种。因此，为了加快中国百合育种进程，需要探究高效成熟的育种方法，并选育具有优良新颖观赏性状的新品种。辐射诱变技术是一种快速有效的育种手段，它能够打破原有植物基因库的限制，诱发基因突变，产生多种变异性状，这对加快百合育种速度具有十分重要的意义。就百合育种方向而言，株型改良一直是百合育种的一个重要目标，其中筛选百合分枝性状不仅能够丰富百合新品种，同时能够增强并延伸百合在庭院，园林绿地及盆栽等方面的用途。而百合生长特性为直立茎不分枝的单一株型模式，目前尚没有分枝株型的报道。因此，分枝株型改良是一个新颖独特且有价值的百合育种目标。现已知独脚金内酯物质是调控植物分枝的重要新型激素，探究百合中独角金内酯的调控机制能够为百合分枝表型选育提供理论指导和实践依据。故本研究将三种辐射诱变技术（伽玛射线60Coγ、质子束H+与12C6+重离子束）与岷江百合离体组织培养体系相结合，分析岷江百合辐射生物学效应，筛选高效的辐射育种材料与诱变源，同时首次鉴定了百合中存在独脚金内酯物质，并克隆了两个参与独脚金内酯合成的关键酶基因，分析了其表达模式。本研究旨在探索高效的百合育种方法，并培育独特的百合新品种。 本研究得到的主要结论如下: (1)以岷江百合种子、鳞片及愈伤组织为试验材料，通过培养条件与培养激素不同组合的优化，调节百合无菌幼苗的分化及增殖，诱导百合完成营养生长与生殖生长过程。结果表明:种子在光照与0.01 mg·L-1NAA的培养件下可发育为健壮幼苗，而在黑暗与高浓度6-BA的培养条件下容易促进愈伤组织的分化;鳞片不定芽增殖最适培养基为MS+NAA0.1 mg·L-1+6-BA0.5 mg·L-1;愈伤组织的最佳增殖培养基为MS+NAA0.1 mg·L-1+6-BA1.0 mg·L-1，且此时的愈伤组织更易分化形成幼苗。随后将上述三种外植体获得的百合幼苗经培养基MS+NAA0.1 mg·L-1+蔗糖60 g/L诱导，可促进百合营养器官鳞茎的形成及底根的发育，从而提高百合无菌幼苗移栽成活率。 (2)伽玛射线(60Coγ)辐照处理岷江百合种子、鳞片及愈伤组织，将各辐射注入剂量与其死亡率之间进行效应拟合，计算得出种子、鳞片及愈伤组织的半致死剂量为4.935、4.367、2.729 Gy，即它们的辐射敏感性大小为愈伤组织＞鳞片＞种子;其中，随着60Coγ辐射剂量的增加，种子的存活率与鳞茎形成率、鳞片的不定芽增殖系数、愈伤组织的增重指数及分化率均受到了明显的线性抑制作用。同时在它们发育过程中均引起了多种畸形变化;另外，根据细胞损伤情况的观察与统计，发现鳞片与种子、愈伤组织相比，前者经辐射处理后其微核率出现显著的升高，细胞分裂指数出现显著的降低，且诱导产生的染色体畸变种类更为丰富。上述结果表明，三种辐射材料相比，鳞片的辐射敏感性适中，辐射畸变率高且繁殖系数高。鳞片是百合辐射诱变育种的适宜材料，更宜获得突变群体。 (3)质子束(H+)辐照处理岷江百合种子、12C6+重离子束辐照处理岷江百合鳞片后，经计算得出它们的半致死剂量分别为1.39、1.52 Gy。其中随着辐射注入剂量的增加，前者引起种子的死亡率、畸变率出现“马鞍型曲线”，而后者引起鳞片的死亡率、不定芽增殖系数出现“多峰波动曲线”;相比伽玛射线，这两种离子束引起的辐射损伤更加严重，染色体畸变类型更加独特与丰富。上述结果表明，三种辐射源相比，离子束引起的辐射生物学效应更加复杂，且诱变育种效率更加高效。 (4)辐射损伤可导致百合再生植株形态发生变异，其中主要表现叶色、叶形、花色、花型、花托角度及株型等方面。其中较为新颖的性状变化为百合分枝株型的出现，通过对此表型的显微切片观察，发现其茎杆分裂处的表皮细胞与薄壁组织向内凹陷，且在分裂处的中心薄壁组织分化出许多小型细胞，推测它们可能为具有旺盛分裂特性的形成层，进而分化出新的组织与器官，从而形成百合分枝结构。 (5)利用瓜列当种子萌发指示实验检测百合独脚金内酯物质存在与否，结果表明‘索邦’、‘耀眼’及新铁炮三种百合品种，在其萌发期、展叶期、开花期与子鳞茎增重期，它们的根际土、地上部各器官、地下部各器官的水或甲醇浸提液均能刺激瓜列当种子萌发。此外，三种百合品种刺激瓜列当种子萌发的能力存在差异，其中‘索邦’与‘耀眼’的地下部各器官刺激作用更强，而新铁炮百合在子鳞茎增重时期，其叶片水浸提液刺激瓜列当种子萌发率可达76.7％，接近独脚金内酯人工合成类似物GR24的刺激效果。综上所述百合在生长发育过程中可以持续分泌瓜列当萌发刺激物质即独脚金内酯物质至土壤中。 (6)利用独脚金内酯合成关键酶基因CCD8的保守区域设计简并引物，在‘索邦’百合中扩增并获得了两个序列相似性为86％的LoCCD8a和LoCCD8b基因，随后通过RACE技术得到了它们的全长序列，分别为1931bp和2051bp;将百合CCD8基因推测的氨基酸序列与双子叶植物拟南芥，单子叶植物水稻和苔藓植物进行Blast比对，其同源性＞60％，这表明CCD8是一个较为保守的基因;随后选取37个物种的CCD8氨基酸序列构建进化树，结果显示百合首先与鸢尾科植物聚类，然后与单子叶植物的其它科属植物进行聚类;此外，分析百合LoCCD8a和LoCCD8b基因在不同生长发育时期及不同组织器官内的表达水平，结果发现这两种基因的表达模式存在差异，且各器官的表达量会随着发育时期的变化而改变。