论文部分内容阅读
微丝束和微丝索等具有高级形态的微丝结构参与了许多重要的植物细胞过程和生理活动,但形成和维持此结构的分子机理目前仍不清楚。微丝解聚因子（Actin Depolymerizing Factor,ADF）是一类在真核生物中非常保守的微丝结合蛋白家族,主要通过微丝解聚和剪切作用参与细胞内微丝骨架的动态调控。最近,拟南芥ADF9被证明丧失了该家族保守的功能,而表现出成束和稳定微丝的能力,本课题组发现同属于ADF第三亚家族的ADF5也具有相似的功能,但有关ADF5的生理生化功能及其生化功能发生异化的机制还未见报道。因此,本文重点研究了ADF5成束微丝的分子机理,以及ADF5在种子发育过程中的作用,主要取得了如下成果:1、adf5 T-DNA插入突变体植株的种子大小、千粒重、种子长度、单株产量、果荚宽度等生理指标都大于野生型,同时adf5突变体幼苗的子叶细胞面积也大于野生型,但细胞数量没有明显发生变化。这些表型完全可以被表达外源ADF5回补,证明拟南芥ADF5参与了植物种子发育过程;2、通过连续观察拟南芥胚发育的进程,发现adf5突变体植株的胚胎发育过程滞后于野生型,从授粉后到胚胎发育成熟,adf5种子发育所需时间比野生型至少延后2-3天;3、通过观察和定量分析adf5突变体子叶细胞中的微丝骨架,发现缺失ADF5显著降低了细胞中微丝和微丝束的含量,并且突变体细胞中的微丝骨架对微丝解聚药物LatB非常敏感,证明ADF5有可能作为一个微丝成束蛋白,在体内参与形成和维持微丝束结构;4、利用高速共沉淀和低速共沉淀等方法,发现ADF5在体外具有pH依赖地稳定和成束微丝的功能,并且ADF5的活性在低pH条件下更强,其生化性质与其它保守的ADFs完全相反;ADF5的N端可以结合微丝,缺失ADF5的N端将导致ADF5成束微丝功能丧失,将ADF5的N端与具有剪切微丝功能的ADF1N端互换后,重组蛋白ADF5N-ADF1C也具有成束微丝的功能,说明ADF5的N端具有结合F-actin的功能位点,也是ADF5生化性质发生异化的关键位点;本论文还发现ADF5在体外不能形成多聚体,定点突变ADF5C端保守的F-actin结合位点也显著降低了ADF5的微丝成束能力,说明ADF5依赖其N端和C端的两个F-actin结合位点成束微丝;5、ADF5N端、ADF5缺失N端以及C端微丝结合位点突变ADF5都不能回补adf5突变体种子发育的表型,说明ADF5主要通过束化和稳定微丝作用参与调控种子发育。本论文首次报道了拟南芥ADF第三亚家族成员--ADF5在体内外都具有稳定和束化微丝的功能,并且主要通过其N端和C端的两个F-actin结合位点参与形成和维持细胞内微丝束等高级结构。此外,还证明了微丝骨架在植物种子发育过程中起着非常重要的作用。