【摘 要】
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研究背景:在成熟的骨骼中,骨再造取代老化和受损的骨。提供钙和磷的来源,保持骨骼健康。为了适应增长和机械荷载的变化,骨组织不断进行自我重塑,以此来保持矿物盐代谢平衡和调节骨髓微环境。骨组织的自我重塑状态异常会导致骨骼系统稳态失调性疾病,比如佩吉特病,关节置换导致的假体周围松动,老年性骨质疏松症等,而破骨细胞功能紊乱是导致骨质疏松的主要原因。因此,调节破骨细胞的分化和功能是针对骨质疏松症的治疗策略之一
【基金项目】
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项目名称:Roquin在骨质疏松症中的分子机制研究,项目合同编号:81501910,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2016.1-2018.12; 项目名称:Furin 在成骨细胞分化及骨形成中的调节机制研究,项目合同编号:81702186,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2018.1-2020.12
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研究背景:在成熟的骨骼中,骨再造取代老化和受损的骨。提供钙和磷的来源,保持骨骼健康。为了适应增长和机械荷载的变化,骨组织不断进行自我重塑,以此来保持矿物盐代谢平衡和调节骨髓微环境。骨组织的自我重塑状态异常会导致骨骼系统稳态失调性疾病,比如佩吉特病,关节置换导致的假体周围松动,老年性骨质疏松症等,而破骨细胞功能紊乱是导致骨质疏松的主要原因。因此,调节破骨细胞的分化和功能是针对骨质疏松症的治疗策略之一。柳穿鱼黄素是从天然中草药植物大蓟炭中分离出的一种活性小分子黄酮类化合物,在本研究中,我们发现柳穿鱼黄素对破骨细胞生成和骨吸收功能的抑制作用,首次在对应的疾病模型中证实了柳穿鱼黄素对卵巢切除小鼠的骨保护作用。目的:研究柳穿鱼黄素影响破骨细胞的形成与功能活性的分子生物学机制;探究柳穿鱼黄素对卵巢切除小鼠模型的作用。实验方法:（1）柳穿鱼黄素对细胞的毒性作用采用CCK-8试剂盒测定,在柳穿鱼黄素的刺激下检测提取自C57/BL6小鼠的股骨和胫骨中冲洗出的巨噬细胞的增殖程度的变化;在确定对骨髓来源的巨噬细胞无毒性作用的药物浓度后,检测柳穿鱼黄素对小鼠骨髓来源的巨噬细胞向破骨细胞分化的作用,其中破骨细胞鉴定为融合后大于或等于3个核的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAc P）染色阳性细胞,显微镜下观察柳穿鱼黄素对破骨细胞面积和数量的影响;（2）通过羟基磷灰石涂片模拟骨片的实验方式,来测定柳穿鱼黄素对破骨细胞的骨吸收功能的影响。同时,运用F-actin ring形成实验来进一步探究破骨细胞在柳穿鱼黄素的干预下其F-actin ring是否发生改变从而骨吸收功能产生的影响。（3）实时荧光定量PCR技术用于检测在不同浓度的柳穿鱼黄素干预的情况下,C57/BL6小鼠骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化过程中的破骨细胞特异性标记基因的表达量是否有改变。（4）利用蛋白免疫印迹技术（Western Blot）研究柳穿鱼黄素刺激后的RANKL诱导的破骨细胞相关信号途径的上关键蛋白的改变,以明确柳穿鱼黄素影响破骨细胞分化和功能的相关分子机制。（5）运用8周龄的雌性C57/BL6小鼠通过外科手术建立卵巢切除模型以模拟小鼠的骨质疏松情况,同时在建模成功后进行为期6周的不同浓度柳穿鱼黄素腹腔注射处理,之后收集小鼠胫骨进行Micro-CT扫描和病理组织切片形态学分析。结果:（1）CCK-8实验结果证明小鼠骨髓来源巨噬细胞在柳穿鱼黄素在20μM以内浓度干预时,细胞活性并未产生明显抑制;（2）破骨细胞体外培养实验结果表明,在不同浓度的柳穿鱼黄素（1.25μM、2.5μM、5μM、10μM）干预下,破骨细胞的分化情况和骨吸收功能都收到明显抑制;（3）q PCR和免疫蛋白印迹实验结果显示,柳穿鱼黄素能使破骨细胞分化过程中的特异性标志基因的表达量下降,并通过调控MAPK和NFATc1等途径影响破骨细胞;（4）柳穿鱼黄素在C57/BL6小鼠卵巢切除模型中能显著改善实验小鼠的骨丢失情况。结论:柳穿鱼黄素在体外能通过下调MAPK信号通路、NFATc1信号通路和c-Fos信号级联和下游关键基因的表达来抑制破骨细胞形成及其骨吸收功能,并在相应的小鼠疾病模型中得到同样的结果,因此根据我们的研究结果,我们推测柳穿鱼黄素是一种治疗破骨细胞功能亢进相关疾病的潜在药物。
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