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发光杆菌(Photorhabdus luminescens)是一种线虫共生细菌。它存在于昆虫病原线虫肠道内,可随线虫的侵染进入寄主昆虫血腔,迅速繁殖并产生多种代谢产物,抑制其它杂菌的污染,从而保护线虫繁殖的环境。发光杆菌1029菌株发酵液对多种植物病菌具有抑制作用,特别是对荔枝霜霉病菌具有非常好的抑制效果。本研究以防治荔枝霜霉病为目的,烟草青枯病病菌为指示菌对发光杆菌1029菌株产素发酵培养基成分进行优化,并分离纯化发光杆菌1029发酵液活性成分,实验室条件下与乙膦铝混配进行防治荔枝霜霉病的初步研究,为进一步研发发光杆菌微生物农药提供科学依据。
经过对发光杆菌1029菌株培养基成分的优化,获得了一个较优的发酵配方。.其培养基配方为:化合物A 16g/L、化合物B 24 g/t,、NaCl 6 g/L、KNO<,3> 1.0 g/L、KH<,2>PO<,4>0.6 g/L、MgCl<,2> 0.98g/L、(NH<,4>)<,2>SO<,4> 3.68 g/L。在28℃、170 r/min条件下发酵72h。在上述条件下,发光杆菌1029液体发酵得到的发酵液抑菌圈直径可达到7.32mm(指示菌为烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum),比优化前6.74mm增加了0.58mm。
实验证明响应面方法对培养基优化是非常有效的工具,采用SAS软件中的Plackett-Burman设计对影响发光杆菌1029液体发酵液抑菌效果的重要因素进行了筛选。从化合物A、化合物B、NaCl、KNO<,3>、MgCl<,2>、(NH<,4>)<,2>SO<,4>和KH<,2>PO<,4>七个考察因素选出MgCl<,2>和(NH<,4>)<,2>SO<,4>为影响实验的两个重要因素。通过响应面分析法建立模型:Y=7.235000-0.097752X<,1>-0.380846X<,2>-0.163750X<,1><]2>-0.220000X<,2>X<,1>-0.378751X<,2><2>推测出在MgCl<,2>为0.98g/L、(NH<,4>)<,2>SO<,4>为3.68 g/L时预测的最大响应值(抑菌圈直径)为7.32mm,经摇瓶发酵实验证实此点的实测值为7.28mm,证明模型是有效的,并且存在极大值点。
发光杆菌1029发酵液活性成分的分离,经液-液萃取和硅胶柱层析分离获得4个馏分,其中馏分1对指示菌(烟草青枯病菌)具有很强的抑菌活性。对馏分1进行薄层层析,得到白色晶体,核磁共振氢谱和质谱分析结果,证实该化合物为:2-isopropyl-5-(2-phenylethenyl)-benzene-1,3-diol(中文命名为:4-异丙基-3,5-二羟基二苯乙烯)采用生长速率法测定发光杆菌1029发酵液活性成分对荔枝霜疫霉病菌的抑菌作用,结果表明对活性成分荔枝霜疫霉病菌具有良好的抑制作用,有效中浓度(EC<,50>)达到11.2μg/ml。
采用HorsfaU提出的试验设计和孙云沛的共毒系数法测定乙膦铝和发光杆菌1029发酵液活性成分混配对荔枝霜疫霉病菌的抑制作用。结果表明,活性成分:乙膦铝=3:7时,共毒系数(CTC)最大,其值为730.7。
发光杆菌1029菌株发酵液的抑菌活性成分对很多植物病原菌具有显著的抑制活性,特别是对荔枝霜疫霉病菌,作为新型的微生物农药具有巨大的开发价值和广阔的应用前景。