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蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)包括受体型酪氨酸激酶和非受体型酪氨酸激酶，通过磷酸化激活下游信号蛋白，在调控细胞反应中起着重要的作用。受体酪氨酸激酶通过与高亲和力的配体结合而被激活，同时激活非受体型酪氨酸激酶和下游信号蛋白。当信号蛋白活性过高时，会引起异常的细胞生长和分化。因此，酪氨酸激酶的异常调控与许多肿瘤的侵袭和不良预后有着密切关系，是恶性肿瘤的重要特征。肿瘤新生血管生成是肿瘤在原有血管上形成新血管的过程，对肿瘤的生长、发展和转移起着非常重要的作用。促进新生血管生成的信号通过血管内皮细胞表面的相关受体酪氨酸激酶进行转导，阻断相关的信号转导能够有效抑制肿瘤新生血管生成，从而稳定和减缓实体瘤的发生、发展。因此，PTK已成为非常重要和有价值的抗肿瘤靶点。迄今为止，已有数十种靶向PTK激酶区的小分子抑制剂进入临床研究阶段，最近，又有两个广谱型酪氨酸激酶抑制剂上市，为PTK抑制剂的开发展示了光明的前景。
为研制具有我国自主知识产权的蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂，本研究中，我们建立了一系列蛋白酪氨酸激酶的分子筛选模型，进行了蛋白酪氨酸激酶抑制剂的筛选工作，并对活性化合物YN-968D1和TKI-30的抗肿瘤机理和抗新生血管生成作用进行了初步研究。
首先，采用Bac-to-BacTM昆虫杆状病毒表达系统表达了具有激酶活性的PDGFRβ受体酪氨酸激酶和c-Src非受体酪氨酸激酶催化活性区蛋白，研究了激酶活性和酶浓度、底物浓度及二价金属离子浓度的关系。然后，基于酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)的原理，建立了灵敏、稳定的PDGFRβ受体酪氨酸激酶和c-Src非受体酪氨酸激酶抑制剂的分子筛选模型。应用建立的蛋白酪氨酸激酶抑制剂分子水平的筛选模型，筛选了近千个化合物，发现了数个具有较强酪氨酸激酶抑制活性的化合物，包括YN-968D1和TKI系列中的TKI-30以及STI571衍生物系列中的100519、100523a、100526a等。
活性化合物YN-968D1是正在进行临床III期试验的新生血管生成抑制剂PTK787的衍生物，它对血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)的抑制活性在纳摩尔(nM)数量级。同时，该化合物还对第三类激酶家族中的PDGFRD和c-Kit有抑制作用，对表皮生长因子受体1、2(EGFR1、ErbB2)和成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)没有抑制作用。YN-968D1与PTK787在分子水平对酪氨酸激酶的抑制谱有所不同，YN-968D1还可以抑制RET受体酪氨酸激酶和c-Src非受体酪氨酸激酶的激酶活性。
在细胞水平上，YN-968D1对不同组织来源的肿瘤细胞增殖抑制作用具有一定的选择性，其中对VEGFR转染的高表达细胞株的增殖抑制作用强于其它细胞株，提示YN-968D1的细胞毒作用与细胞中VEGFR表达水平有一定的相关性。进而，检测到YN-968D1能剂量依赖性地抑制VEGF刺激的VEGFR2及其下游重要信号分子磷酸化水平和整合素信号通路中的粘着斑激酶(FAK)的磷酸化水平。
另外，YN-968D1从多个环节抑制新生血管生成。它能抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖，在以VEGF为刺激因子时IC50值为2.7±1.0μM，以血清为刺激物时浓度上升到10μ时的抑制率不到50％。在体外，其能抑制VEGF诱导的内皮细胞的迁移及血清刺激的初级管腔的形成。此外，YN-968D1还能够抑制VEGF诱导的大鼠动脉环血管萌发，1μM作用下则几乎没有任何萌芽产生。在C57BL/6J小鼠体内种入混有该化合物和VEGF的Matrigel，10μMYN-968D1作用组，团块内浸润的细胞数与VEGF组相比明显减少；100μM作用下则几乎没有细胞长入团块，显著抑制了VEGF诱导的血管生成。
另一个小分子化合物TKI-30能够有效地抑制PDGFRβ和c-Src酪氨酸激酶活性，其抑制的IC50值分别为0.34±0.06μ和0.37±0.08μM。应用本实验室建立的一系列蛋白酪氨酸激酶抑制剂筛选模型检测证实，TKI-30能够有效抑制KDR.c-Kit和ErbB2酪氨酸激酶活性，IC50值分别为1.03、0.65和2.47μM，而对EGFR1、FGFR1、FGFR2和Fit-1没有明显的抑制作用。
在细胞水平上进一步证实了TKI-30对酪氨酸激酶PDGFRβ和c-Src的抑制作用。在小鼠Swiss3T3细胞中，TKI-30能有效抑制PDGF-BB刺激的PDGFRβ酪氨酸激酶自磷酸化。在人结肠癌HT-29细胞中c-Src自磷酸化也被有效抑制。并且TKI-30对这两者在细胞水平上的IC50与分子水平相当。同时，在Swiss3T3细胞中检测了TKI-30对PDGFRβ受体下游信号转导通路中重要信号分子的影响，结果表明，TKI-30明显下调了PDGF-BB刺激后的ERK1/2、AKT、PLCγ、p38MAPK、c-Jun和STAT3的磷酸化。
进而，体外检测了TKI-30对新生血管生成的作用。TKI-30在短时间内对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)没有细胞毒作用，在高剂量长时间作用时对HUVEC细胞的增殖有一定的抑制作用。同时显微荧光术、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测到TKI-30可剂量依赖性地诱导HUVEC细胞凋亡。TKI-30能够有效地抑制HUVEC细胞迁移和管腔形成，提示其具有新生血管抑制作用。
此外，还研究了TKI-30对肿瘤细胞的细胞毒作用及凋亡诱导作用。结果显示，TKI-30对肿瘤细胞的生长有一定的抑制作用。TKI-30的抗肿瘤作用与凋亡的诱导有关，流式细胞术检测到TKI-30在高剂量时可诱导HCT-116和HT-29细胞的凋亡。
综上所述，对广谱型酪氨酸激酶抑制剂YN-968D1和TKI-30的抗肿瘤作用及其机理的初步研究，显示它们同时具有抗肿瘤作用和抗新生血管生成作用的特性，为该两个化合物的深入研究研发提供了详实的实验依据。