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阿尔兹海默症(AD)是一种进行性且不可逆的神经退行性疾病，严重影响患者的生活质量和寿命。目前，还没有能够完全有效治疗AD的药物。很多具有治疗或者缓解AD症状的候选药物仍处于研发阶段，例如2-吡咯烷酮衍生物GFKP-19，在AD动物模型中具有潜在的神经保护作用，可以提高记忆障碍小鼠的记忆能力。这些候选药物作用的分子机制仍需要深入研究。近年来，大规模定量蛋白质组和磷酸化蛋白质组技术迅速发展，成为药物作用信号通路研究的一个有效工具。本研究建立了基于SILAC(stable isotope labeling by amino acids in cell culture)标记的定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的方法，对GFKP-19在Neuro-2a细胞中的神经保护作用机制进行了深入研究。在空白对照组、Aβ25-35造模组和GFKP-19保护组细胞中，通过定量蛋白质组学分析，共鉴定到6，727个蛋白质，其中5，180个蛋白质有定量信息。三次重复实验数据的变异系数小、重复性好，肽段鉴定的质谱谱图质量高。发现在24小时药物处理的蛋白质组学实验中，筛选出来的显著差异蛋白质在所有定量蛋白质中占的比例小于1％，表明Aβ25-35和GFKP-19短时程处理导致蛋白质表达水平的变化非常小。因此，初步推断GFKP-19的神经保护作用可能主要作用于蛋白质磷酸化的信号传导通路上。所以，将研究重点放在定量磷酸化蛋白质组学实验上，为了获得深度覆盖磷酸化蛋白质组学数据，同时在Q Exactive和Q Exactive HF两台质谱仪器上平行分析样品，共鉴定到25，715个磷酸化位点，包括18，505个高可信度的一类磷酸化位点，14，761个一类磷酸化位点具有定量信息，两台质谱仪器之间的定量数据具有良好的相关性。通过对比Q Exactive和Q ExactiveHF采集的磷酸化蛋白质组数据，发现相同采集时间内，Q Exactive HF鉴定的磷酸化肽段多于Q Exactive。对比分析药物处理4小时和24小时样品的磷酸化蛋白质组数据，发现Neuro-2a细胞中蛋白质的磷酸化水平在4小时药物处理后出现较为显著的变化。因此，着重分析了药物处理4小时样品的磷酸化蛋白质组数据，以SILAC比值对照组/Aβ25-35处理组和GFKP-19保护组/Aβ25-35处理组的变化倍数一个大于1.5而另一个大于1.2为标准筛选差异磷酸化位点，总共筛选出1，180个差异磷酸化位点。对这些差异磷酸化位点进行细胞功能的Gene Ontology富集分析，发现这些蛋白质的功能多数与细胞骨架功能密切相关，同时还发现Tau蛋白的6个位点的磷酸化水平在Aβ25-35处理后显著上调，而在GFKP-19处理后显著下调。联系到AD的Tau蛋白假说，对差异磷酸化蛋白质中的激酶和磷酸酶进行相互作用分析，发现Tau蛋白可能的激酶MAPK14在T180位的磷酸化平与Tau蛋白磷酸化水平的变化趋势一致，并且T180位的磷酸化为MAPK14的激活所必须。一氧化氮和超氧化物阴离子反应产生的过氧亚硝酸根会引起神经细胞的氧化应激反应，与AD的发病进程相关，而发现一氧化氮合成酶NOS1在S847位的磷酸化水平于Aβ25-35处理后显著下调，而在GFKP-19处理后显著上调，并且S847位的磷酸化会降低NOS1的酶活。综上所述，GFKP-19可以逆转Aβ25-35在Neuro-2a细胞中引起的磷酸化水平变化，并且可能通过两条途径保护神经细胞:1）通过上调一氧化氮合成酶NOS1在S847位的磷酸化水平来减少NO引起的氧化损伤和炎症反应;2）通过下调激酶MAPK14在T180位的磷酸化水平来减少Tau蛋白的过度磷酸化。本研究首次通过基于SILAC的定量磷酸化蛋白质组学策略解析阿尔兹海默症候选药物的作用机制，并在阿尔兹海默症细胞模型上发现了与神经保护药物相关的蛋白质磷酸化网络变化。本研究中所用基于SILAC的定量磷酸化蛋白质组方法也可应用于其他神经保护药物的分子机制研究。