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桃(Prunuspersica)是多年生落叶果树,桃发枝率及成枝力强,管理不善,易造成树体郁闭,进而影响桃品质和效益。多效唑(Paclobutrazol,PP333)是一种高效广谱的植物生长延缓剂,可有效控制桃树过度的营养生长。赤霉素(Gibberellin,GA)是决定桃新梢生长的重要激素。本课题组前期通过比较转录组数据分析筛选出差异表达基因为GA20ox基因,与GA的相关性最为显著。因此,从分子水平阐明赤霉素对多效唑的响应以及与PpGA20ox家族基因相互作用的关系,可能为多效唑抑制赤霉素水平进而调控树体生长势提供新机制,具有重要的理论和实践意义。本研究以‘黄金冠’为试验材料,对其进行外源PP333处理,测量统计新梢生长指标和内源GAs含量;利用实时荧光定量PCR分析GA3合成与代谢途径和信号传导途径中关键基因在不同时期表达量的变化情况;克隆出桃PpGA20ox家族的3个基因(PpGA20ox1、PpGA20ox2和PpGA20ox3)进行生物学信息分析,并结合瞬时转化烟草以及转基因拟南芥试验,分析了其生物学功能以及对PP333感受能力的差异,主要结果如下:1、‘黄金冠’桃喷施1500mg/L PP333,在PP333处理后第4d桃新梢表现显著的生长抑制,第7d表现出节间缩短,15d后枝条基木停长;细胞伸长相关基因EXP和XTH表达显著下调并在第7d下调幅度达到最大。该结果表明PP333可有效抑制桃新梢的生长。2、利用qPCR技术,分别检测PP333处理后‘黄金冠’桃嫩梢中GA合成代谢及信号转导路径中关键基因的表达情况。结果显示,PP333处理后桃树体内活性GA持续下降;喷施初期赤霉素合成基因CPS、KS、KAO、KO、GA20ox、GA3ox的表达量均在不同时间段高于对照而后期表达被抑制,说明树体通过赤霉素的前馈及反馈调节机制来维持其正常生长,其中GA20ox基因受反馈调节的时间较其他合成基因最短,这可能是多效唑抑制桃新梢生长的重要原因之一;赤霉素代谢基因GA2ox的表达量与对照趋势较为一致且变化幅度较小,表明GA含量的减少与代谢作用关系不大。GA信号路径中相关基因DELLA、GID1b、SLY1在PP333处理后其表达量在不同时期均表现出略微下调趋势,推测PP333在转录水平上通过降低大量GA信号路径中相关基因表达水平,从而减弱了 GA信号转导对植物的生长调控,抑制了桃树新梢伸长。3、通过同源比对,克隆得到PpGA20ox1、PpGA20ox2和PpGA20ox3,测序得CDS全长分别为1184bp、1164bp、1064bp;编码氨基酸387、387、384个。生物信息分析表明PpGA20ox蛋白为稳定蛋白,无跨膜结构域,无信号肽,含有高度保守的20G-Fe(Ⅱ)-Oxy蛋白结构域、Fe2+结合位点和2-酮戊二酸结合位点。系统进化分析表明PpGA20ox1、PpGA20ox2和PpGA20ox3的氨基酸序列与分别与杏和梅花中对应基因成员亲缘关系较近,在桃中PpGA20ox2和PpGA20ox3同源性高,说明GA20ox基因在遗传进化方面较为保守且符合遗传进化规律。构建瞬时表达载体pROKⅡ-PpGA20ox-GFP转化烟草叶片显示PpGA20ox1定位在细胞膜和细胞核中;PpGA20ox2和PpGA20ox3均定位于细胞核和细胞质,推测这两个基因在功能上可能具有较高的相似性。4、PCR鉴定分别获得PpGA20ox1、PpGA20ox2、PpGA20ox3转基因T3代拟南芥稳定的纯系植株,对其进行表型分析表明,与非转基因植株相比,过表达的转基因植株在萌发速率、根长、叶面积、结实量和株高上都有所提高。其中PpGA20ox1对植株地上部分器官的发育具有更明显的促进作用,叶片中活性GA含量更高;PpGA20ox2和PpGA20ox3更能促进植株根的伸长。用浓度为50mg/L的PP333处理各转基因植株,其生长受抑制程度由弱到强依次为PpGA20ox1、PpGA20ox2、PpGA20ox3,这表明PpGA20ox1在阻碍PP333药效的发挥上有更重要作用。