论文部分内容阅读
蜘蛛丝是一种优质的蛋白聚合纤维，具有强度高、弹性大、抗辐射、热稳定和生物可降解等特性，在军工、航空航天以及生物医学工程等领域有着巨大的潜在应用价值。牵引丝作为蛛丝的一种，亦享有“生物钢”的美誉，倍受研究者的青睐。
蜘蛛具有种内残食性，产丝量也远低于家蚕，不宜通过驯养集取蛛丝。因而利用基因工程技术合成蛛丝蛋白进而纺制蛛丝成为仿生“蛛丝”开发的必经之路。研究表明，典型蛛丝蛋白如牵引丝蛋白(MaSp)，是一种罕见的单一外显子编码的超高分子量蛋白质，具有高度重复的一级结构，单纯PCR技术无法获取其全长基因编码序列。因此，基于基因组文库构建和克隆筛选技术获取蛛丝蛋白全长基因编码序列成为首选策略。
大腹园蛛(Araneus ventricosus)广泛分布于我国各地，其蛛丝性能优良。但至今为止，大腹园蛛MaSp编码基因信息仍知之甚少，仅少数3'端部分序列被报道，且均小于2.0Kb。为获取大腹园蛛更多乃至全长MaSp编码基因序列，从而为仿生“蛛丝”开发提供基因蓝图，本课题开展了如下研究工作：
(1)Fosmid文库构建的前期准备：为保证Fosmid文库的完整性，建立了适于蜘蛛高分子量基因组DNA(High Molecular Weight Genomic DNA，HMW-gDNA)的提取方法——改良CTAB法。该方法无需液氮研磨，具有成本低、耗时短和效率高等优点。利用此方法制备的DNA分子量高(＞48.5Kb)、纯度好(OD260/OD280=1.7～1.9)以及得率高（约147ng HMW-gDNA/mg肌肉组织），满足分子生物学实验的要求。基于高分子量DNA快速高效回收的难题，利用常规实验材料自主构建了电洗脱快速选择性回收装置。通过该装置对构建Fosmid文库所需的DNA片段（约30～40Kb）进行分离回收，回收率高达75％以上，回收产物纯度高(OD260/OD280=1.8～2.0)。另外，还利用该装置对λDNA/HindⅢ Marker(23.1、9.4、6.6以及4.4Kb)进行回收，结果证实了该装置的优越性。
(2) Fosmid文库的构建：纯化的大腹园蛛HMW-gDNA片段经末端补平磷酸化后，连入pCC2FOSTM载体，通过Lambda Packaging Extracts体外包装并转染EP1300TM-T1R E.coli，成功构建了无偏向性的大腹园蛛Fosmid文库，其滴定度在6.0×104～1.1×105之间，共产生约3.9×105个文库克隆（存于约1042块384-well plates中），约覆盖大腹园蛛基因组7倍。
(3)MaSp基因的STS/3D-PCR筛选与鉴定：根据已公布的MaSp氨基酸序列，设计并合成MaSp1及MaSp2非重复区编码序列5'端和3'端的简并引物并进行简并PCR扩增。产物经测序分析证实为MaSp1 N端(227bp)和C端(195bp)及MaSp2C端(171bp)非重复区部分编码序列，并分别确定为MaSp的STS(Sequence taggedsite)序列，并以此设计了3对特异性引物用于大腹园蛛Fosmid文库的STS/3D-PCR筛选。将1042块384-well plates分成约26批次(每批次40块384-well plates)，并分别构建一级混合池(Primary pools)、二级混合池(Secondary pools)和超级池( Super pools)。基于STS/3D-PCR对文库超级、一级和二级混合池进行筛选，得到含有MaSp2全长编码基因的两个阳性克隆，分别命名为FM2-0811和FM2-1124。通过Shotgun测序法对阳性克隆进行测序分析，得到MaSp2编码基因部分序列(1950bp)，命名为MaSp2-1。MaSp2-1与NCBI收录的MaSp2部分编码序列同源性高达100％，在其一个阅读框架内推导的氨基酸序列含有大量(A)n、(GA)n和(GGX)n等MaSp的典型模体(motif)。另外，我们还获得了大腹园蛛骨骼肌肉蛋白(Skeletal muscle protein)编码基因5端新序列(977bp)，命名为AvSmp-1。该序列内部存在数个间隔分布的高度保守外显子（约48bp）和内含子（约33bp），并与已公布的唯一一条狼蛛(Tarantula)骨骼肌蛋白N端mRNA序列具有87％的同源性，其具体功能有待于进一步验证。目前，FM2-0811和FM2-1124的全长测序工作正在进行。
通过本项研究，成功构建了无偏向性的大腹园蛛Fosmid文库，并在简并PCR基础上设计STS特异性筛选引物对文库进行STS/3D-PCR筛选，获得了携带大腹园蛛MaSp全长编码基因的阳性克隆，经Shotgun测序得到了MaSp基因新序列，对进一步深入研究和仿生“蛛丝”打下了良好的基础。另外，本论文还建立了适合蜘蛛HMW-gDNA提取的有效方法——改良CTAB法，并利用常规实验材料自主构建了电洗脱快速选择性回收装置，解决了蜘蛛HMW-gDNA提取及高分子量DNA快速高效回收的难题。