论文部分内容阅读
本文报道了对棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus, HearNPV) ORF33基因敲除研究的初步结果及ChiA对HearNPV的增效作用研究结果。取得的主要结果如下:利用已经构建好的pGEM-4T-2-ORF33表达载体,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,GST融合表达产物的大小为43kDa,与预期大小一致。表达蛋白经初步纯化(包涵体纯化与凝胶电泳分离相结合的方法),免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。经ELISA和western blot检测,获得了特异性较强的抗体,抗体效价为:2.56×10~5。以含有氯霉素抗性基因(Cmr)和加强型绿色荧光蛋白基因(egfp)的PKSE载体为母体,构建了基因缺失载体,含有ORF33基因同源臂的可供同源交换的线性片段。借助含有λ噬菌体Red重组系统的质粒pKD46及HearNPV基因组Bacmid,在大肠杆菌HZ8中进行同源重组。通过PCR及酶切鉴定,HearNPV ORF33基因缺失型重组病毒基因组Bacmid构建成功。用PCR方法扩增出不含N端信号肽编码序列的几丁质酶基因片段,并分别克隆至原核表达载体PMAL-p2x和PET-32a中,并分别在大肠杆菌E.coli TBI和E.coli DE3中进行了融合表达。在大肠杆菌E.coli TB1中表达量约占细菌总蛋白15.8%,其中20.0%为可溶性表达;在E.coliDE3中表达量约占细菌总蛋白26.8%,其中30.2%为可溶性表达。将DE3表达粗产物与HearNPV病毒按不同比例混合喂食3龄棉铃虫,测定其对HearNPV的增效作用。表达的可溶性HearNPV ChiA蛋白粗产物在2.0μg/ ml的添加水平,死亡率比对照病毒高出47.0%。