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目的：
通过夹脊电针干预ALS-SOD1G93A转基因小鼠，观察其对小鼠生存期、行为学及其对腰髓前角运动神经元形态学影响，以Akt/CREB信号通路对运动神经元细胞的影响机制为切入点，探讨夹脊电针治疗ALS的可能作用机制，为夹脊电针治疗ALS提供实验依据。
方法：
实验一：ALS-SOD1G93A转基因小鼠的鉴定及夹脊电针治疗对其行为学的影响：1.ALS-SOD1G93A转基因小鼠的鉴定：应用美国Jackson实验室提供的引物序列和方案对ALS-SOD1G93A转基因小鼠进行PCR鉴定，并对小鼠的表型特征进行观察。2.分组及治疗：按随机数字表法将24只ALS-SOD1G93A转基因小鼠随机分为电针治疗组、手针治疗组、阳性对照组，每组各8只，同窝野生型小鼠8只作为阴性对照。于小鼠日龄60天开始治疗，手针治疗组针刺双侧L1~2、L5~6夹脊穴；电针治疗组予以夹脊电针治疗；模型组予以捆绑固定；每周2次，每次20分钟，连续治疗4周。3.行为学观察：采用转棒实验、悬吊试验、称重、神经功能评估观察小鼠发病及疾病进展情况。
实验二：夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元AEG-1表达的影响：1.分组及处置：同实验一。2.HE染色观察各组小鼠腰髓前角运动神经元形态变化及运动神经元计数。3.免疫荧光染色、免疫组化、WesternBlot法、qRT-PCR法观察各组小鼠腰髓前角AEG-1表达。
实验三：夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓Akt/CREB通路相关蛋白的影响：1.分组及处置：同第一部分实验。2.WesternBlot检测脊髓前角组织中p-Akt、p-GSK-3β、p-CREB蛋白表达。
结果：
1.ALS-SOD1G93A转基因小鼠的鉴定：PCR鉴定：阳性率为40%～50%。表型特征：小鼠于日龄80～95天左右时陆续发病，悬尾时，后肢伸展明显不完全，并伴有单侧或双侧后肢震颤；日龄100～120天左右时，行走能力下降，后肢肌肉萎缩，或行走时后肢呈拖拽状；而后疾病逐渐加重，逐渐出现后肢肌肉强直性瘫痪，行动主要靠前肢爬行，小鼠呈弓背状，独立自由获取食物的能力逐渐丧失；至日龄140天左右时，将小鼠侧倒放置于实验台上，小鼠在20～30s内不能够自主翻身，判定为终末期。
2.体重分析：与模型组比较，手针治疗组、电针治疗组均能明显延缓小鼠体重丢失，有显著性差异（P＜0.05）；与手针治疗组比较，电针治疗组在延缓小鼠体重丢失方面更显著（P＜0.05）。
3.发病时间和生存期分析：阳性对照组、手针治疗组、电针治疗组小鼠发病时间分别为（89.88±5.84）d、（94.88±4.07）d、（106.13±6.60）d；与阳性对照组比较，手针治疗组、电针治疗组小鼠发病时间均明显延缓（P＜0.05，P＜0.01）；与手针治疗组比较，电针治疗组延缓小鼠发病时间更显著（P＜0.05）。阳性对照组、手针治疗组、电针治疗组小鼠生存期分别为（136.63±5.50）d、（145.63±4.44）d、（154.25±5.44）d；与阳性对照组比较，手针治疗组、电针治疗组小鼠生存期均明显延长（P＜0.05，P＜0.01）；与手针治疗组比较，电针治疗组延长小鼠生存期更显著（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析可知，电针治疗组生存期明显高于阳性对照组和手针治疗组（P＜0.01）。
4.转棒实验分析：与模型组比较，从日龄110天至日龄131天，手针治疗组和电针治疗组小鼠转棒运动功能明显得到改善（P＜0.05，P＜0.01）；从日龄113天至日龄131天，电针治疗组小鼠转棒实验潜伏期明显高于手针治疗组（P＜0.05）。
5.悬吊实验分析：与模型组比较，从日龄110天至日龄131天，手针治疗组和电针治疗组小鼠悬吊实验潜伏期明显提高（P＜0.05，P＜0.01）；从日龄113天至日龄131天，电针治疗组小鼠悬吊实验潜伏期明显高于手针治疗组（P＜0.05）。
6.形态学：（1）HE染色可见：野生型对照组：镜下观察发现，野生型小鼠腰髓前角的运动神经元数量正常，细胞的形态规则、结构完整、轮廓清晰，没有发现水肿、空泡等细胞损伤表现，细胞各结构染色均匀，核仁清晰，无特异性改变。阳性对照组：镜下观察发现，阳性对照组小鼠腰髓前角运动神经元细胞数目较正常组织显著减少，腰髓前角组织疏松水肿，神经细胞形态不规则、结构改变、胞体变性，胞质胞核染色不均匀、不清晰，出现核固缩和空泡状改变。手针治疗组：镜下观察发现，手针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元数目较阳性对照组稍多，神经细胞结构形态较阳性组略佳，但神经元细胞核染色不清及空泡化仍较明显存在。电针治疗组：镜下观察发现，经电针治疗后小鼠腰髓前角运动神经元数明显高于阳性对照组、手针治疗组，神经元细胞的结构和形态明显改善，仅存少量染色不清的神经元细胞，空泡化细胞数量亦显著减少。（2）运动神经元计数：与野生型对照组相比，阳性对照组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少（P＜0.01）；治疗后，与阳性对照组比较，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元数量明显增加（P＜0.05，P＜0.01）；与手针治疗组比较，电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元数量增加更明显（P＜0.05）。
7.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元AEG-1表达的影响：本实验中，取小鼠腰髓前角进行免疫组化观察各组小鼠腰髓前角AEG-1表达情况。从经Image-proPlus软件分析结果来看，与野生型对照组相比，阳性对照组小鼠腰髓前角AEG-1表达明显减少（P＜0.01）；治疗后，与阳性对照组比较，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元AEG-1表达量明显增加（P＜0.05，P＜0.01）；与手针治疗组比较，电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元AEG-1表达量增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。从WesternBlot和qRT-PCR检测结果来看，与野生型对照组相比，阳性对照组小鼠腰髓前角AEG-1蛋白和AEG-1mRNA表达明显减少（P＜0.01）；治疗后，与阳性对照组比较，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角AEG-1蛋白和AEG-1mRNA表达明显增加（P＜0.05，P＜0.01）；与手针治疗组比较，电针治疗组小鼠腰髓前角AEG-1蛋白和AEG-1mRNA表达明显增加（P＜0.05）。
8.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角p-Akt蛋白表达的影响：与野生型对照组相比，阳性对照组、手针治疗组小鼠腰髓前角p-Akt表达明显减少（P＜0.01）；经治疗后，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元p-Akt表达量较阳性对照组明显增加（P＜0.05，P＜0.01），且电针治疗组较手针治疗组增多更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。
9.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角p-GSK-3β蛋白表达的影响：与野生型对照组相比，阳性对照组、手针治疗组小鼠腰髓前角p-GSK-3β表达明显减少（P＜0.01）；经治疗后，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元p-GSK-3β表达量较阳性对照组明显增加（P＜0.05，P＜0.01），且电针治疗组较手针治疗组增多更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。
10.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角p-CREB蛋白表达的影响：与野生型对照组相比，阳性对照组、手针治疗组小鼠腰髓前角p-CREB表达明显减少（P＜0.01）；经治疗后，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元p-CREB表达量较阳性对照组明显增加（P＜0.05，P＜0.01），且电针治疗组较手针治疗组增多更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。
结论：
1.夹脊电针能够改善ALS-SOD1G93A转基因小鼠的运动功能，延缓发病，延长生存期，其效果优于手针治疗治疗。
2.夹脊电针可以改善ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学变化，其效果优于手针治疗治疗。
3.夹脊电针通过激活Akt/CREB信号通路，增强小鼠腰髓前角运动神经元p-Akt表达，使下游GSK-3β磷酸化水平提高，上调p-CREB和AEG-1的表达，减轻运动神经元损伤，提高ALS-SOD1G93A转基因小鼠的运动功能，延缓发病，延长生存期，起到防治ALS的目的。
通过夹脊电针干预ALS-SOD1G93A转基因小鼠，观察其对小鼠生存期、行为学及其对腰髓前角运动神经元形态学影响，以Akt/CREB信号通路对运动神经元细胞的影响机制为切入点，探讨夹脊电针治疗ALS的可能作用机制，为夹脊电针治疗ALS提供实验依据。
方法：
实验一：ALS-SOD1G93A转基因小鼠的鉴定及夹脊电针治疗对其行为学的影响：1.ALS-SOD1G93A转基因小鼠的鉴定：应用美国Jackson实验室提供的引物序列和方案对ALS-SOD1G93A转基因小鼠进行PCR鉴定，并对小鼠的表型特征进行观察。2.分组及治疗：按随机数字表法将24只ALS-SOD1G93A转基因小鼠随机分为电针治疗组、手针治疗组、阳性对照组，每组各8只，同窝野生型小鼠8只作为阴性对照。于小鼠日龄60天开始治疗，手针治疗组针刺双侧L1~2、L5~6夹脊穴；电针治疗组予以夹脊电针治疗；模型组予以捆绑固定；每周2次，每次20分钟，连续治疗4周。3.行为学观察：采用转棒实验、悬吊试验、称重、神经功能评估观察小鼠发病及疾病进展情况。
实验二：夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元AEG-1表达的影响：1.分组及处置：同实验一。2.HE染色观察各组小鼠腰髓前角运动神经元形态变化及运动神经元计数。3.免疫荧光染色、免疫组化、WesternBlot法、qRT-PCR法观察各组小鼠腰髓前角AEG-1表达。
实验三：夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓Akt/CREB通路相关蛋白的影响：1.分组及处置：同第一部分实验。2.WesternBlot检测脊髓前角组织中p-Akt、p-GSK-3β、p-CREB蛋白表达。
结果：
1.ALS-SOD1G93A转基因小鼠的鉴定：PCR鉴定：阳性率为40%～50%。表型特征：小鼠于日龄80～95天左右时陆续发病，悬尾时，后肢伸展明显不完全，并伴有单侧或双侧后肢震颤；日龄100～120天左右时，行走能力下降，后肢肌肉萎缩，或行走时后肢呈拖拽状；而后疾病逐渐加重，逐渐出现后肢肌肉强直性瘫痪，行动主要靠前肢爬行，小鼠呈弓背状，独立自由获取食物的能力逐渐丧失；至日龄140天左右时，将小鼠侧倒放置于实验台上，小鼠在20～30s内不能够自主翻身，判定为终末期。
2.体重分析：与模型组比较，手针治疗组、电针治疗组均能明显延缓小鼠体重丢失，有显著性差异（P＜0.05）；与手针治疗组比较，电针治疗组在延缓小鼠体重丢失方面更显著（P＜0.05）。
3.发病时间和生存期分析：阳性对照组、手针治疗组、电针治疗组小鼠发病时间分别为（89.88±5.84）d、（94.88±4.07）d、（106.13±6.60）d；与阳性对照组比较，手针治疗组、电针治疗组小鼠发病时间均明显延缓（P＜0.05，P＜0.01）；与手针治疗组比较，电针治疗组延缓小鼠发病时间更显著（P＜0.05）。阳性对照组、手针治疗组、电针治疗组小鼠生存期分别为（136.63±5.50）d、（145.63±4.44）d、（154.25±5.44）d；与阳性对照组比较，手针治疗组、电针治疗组小鼠生存期均明显延长（P＜0.05，P＜0.01）；与手针治疗组比较，电针治疗组延长小鼠生存期更显著（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析可知，电针治疗组生存期明显高于阳性对照组和手针治疗组（P＜0.01）。
4.转棒实验分析：与模型组比较，从日龄110天至日龄131天，手针治疗组和电针治疗组小鼠转棒运动功能明显得到改善（P＜0.05，P＜0.01）；从日龄113天至日龄131天，电针治疗组小鼠转棒实验潜伏期明显高于手针治疗组（P＜0.05）。
5.悬吊实验分析：与模型组比较，从日龄110天至日龄131天，手针治疗组和电针治疗组小鼠悬吊实验潜伏期明显提高（P＜0.05，P＜0.01）；从日龄113天至日龄131天，电针治疗组小鼠悬吊实验潜伏期明显高于手针治疗组（P＜0.05）。
6.形态学：（1）HE染色可见：野生型对照组：镜下观察发现，野生型小鼠腰髓前角的运动神经元数量正常，细胞的形态规则、结构完整、轮廓清晰，没有发现水肿、空泡等细胞损伤表现，细胞各结构染色均匀，核仁清晰，无特异性改变。阳性对照组：镜下观察发现，阳性对照组小鼠腰髓前角运动神经元细胞数目较正常组织显著减少，腰髓前角组织疏松水肿，神经细胞形态不规则、结构改变、胞体变性，胞质胞核染色不均匀、不清晰，出现核固缩和空泡状改变。手针治疗组：镜下观察发现，手针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元数目较阳性对照组稍多，神经细胞结构形态较阳性组略佳，但神经元细胞核染色不清及空泡化仍较明显存在。电针治疗组：镜下观察发现，经电针治疗后小鼠腰髓前角运动神经元数明显高于阳性对照组、手针治疗组，神经元细胞的结构和形态明显改善，仅存少量染色不清的神经元细胞，空泡化细胞数量亦显著减少。（2）运动神经元计数：与野生型对照组相比，阳性对照组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少（P＜0.01）；治疗后，与阳性对照组比较，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元数量明显增加（P＜0.05，P＜0.01）；与手针治疗组比较，电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元数量增加更明显（P＜0.05）。
7.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元AEG-1表达的影响：本实验中，取小鼠腰髓前角进行免疫组化观察各组小鼠腰髓前角AEG-1表达情况。从经Image-proPlus软件分析结果来看，与野生型对照组相比，阳性对照组小鼠腰髓前角AEG-1表达明显减少（P＜0.01）；治疗后，与阳性对照组比较，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元AEG-1表达量明显增加（P＜0.05，P＜0.01）；与手针治疗组比较，电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元AEG-1表达量增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。从WesternBlot和qRT-PCR检测结果来看，与野生型对照组相比，阳性对照组小鼠腰髓前角AEG-1蛋白和AEG-1mRNA表达明显减少（P＜0.01）；治疗后，与阳性对照组比较，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角AEG-1蛋白和AEG-1mRNA表达明显增加（P＜0.05，P＜0.01）；与手针治疗组比较，电针治疗组小鼠腰髓前角AEG-1蛋白和AEG-1mRNA表达明显增加（P＜0.05）。
8.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角p-Akt蛋白表达的影响：与野生型对照组相比，阳性对照组、手针治疗组小鼠腰髓前角p-Akt表达明显减少（P＜0.01）；经治疗后，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元p-Akt表达量较阳性对照组明显增加（P＜0.05，P＜0.01），且电针治疗组较手针治疗组增多更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。
9.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角p-GSK-3β蛋白表达的影响：与野生型对照组相比，阳性对照组、手针治疗组小鼠腰髓前角p-GSK-3β表达明显减少（P＜0.01）；经治疗后，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元p-GSK-3β表达量较阳性对照组明显增加（P＜0.05，P＜0.01），且电针治疗组较手针治疗组增多更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。
10.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角p-CREB蛋白表达的影响：与野生型对照组相比，阳性对照组、手针治疗组小鼠腰髓前角p-CREB表达明显减少（P＜0.01）；经治疗后，手针治疗组、电针治疗组小鼠腰髓前角运动神经元p-CREB表达量较阳性对照组明显增加（P＜0.05，P＜0.01），且电针治疗组较手针治疗组增多更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。
结论：
1.夹脊电针能够改善ALS-SOD1G93A转基因小鼠的运动功能，延缓发病，延长生存期，其效果优于手针治疗治疗。
2.夹脊电针可以改善ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学变化，其效果优于手针治疗治疗。
3.夹脊电针通过激活Akt/CREB信号通路，增强小鼠腰髓前角运动神经元p-Akt表达，使下游GSK-3β磷酸化水平提高，上调p-CREB和AEG-1的表达，减轻运动神经元损伤，提高ALS-SOD1G93A转基因小鼠的运动功能，延缓发病，延长生存期，起到防治ALS的目的。