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聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose) polymerase，PARP）抑制剂是新型高选择性抗肿瘤药物。首个PARP抑制剂Olaparib（代号:AZD2281）于2014年12月被美国和欧盟同时批准上市用于治疗BRCA缺陷的晚期卵巢癌。尤文氏瘤是儿童和青少年最常见的恶性骨肿瘤，占所有原发性骨肿瘤的6％～8％，恶性程度高，病程短，转移快;融合基因EWS-FLI1或EWS-ERG的形成是其发病的重要原因。临床前研究显示，尤文氏瘤细胞对PARP抑制剂包括Olaparib高度敏感;但在Ⅱ期临床试验中，Olaparib对标准化疗失败的难治性尤文氏瘤患者未显示确切疗效，原因未明。SOMCL-9112是中国科学院上海药物研究所自主研发的新型强效PARP抑制剂，体外对尤文氏瘤细胞具有很强的增殖生长抑制作用，但遗憾的是体内未显示明显的实验性治疗作用。本论文在初步阐明SOMCL-9112对尤文氏瘤细胞的增殖生长抑制作用和机制的基础上，通过建立2株不同的尤文氏瘤细胞对SOMCL-9112的耐药株，阐明其耐药特性并探索其耐药机制，期望有助于深入了解影响尤文氏瘤对PARP抑制剂敏感性的因素，并为发现克服其耐药性的措施奠定基础。 SOMCL-9112对尤文氏瘤SK-ES-1和RD-ES细胞增殖生长抑制作用强，IC50分别为0.11μM和0.18μM，分别比Olaparib的作用强33倍和16倍。SOMCL-9112诱导SK-ES-1细胞产生DNA损伤导致γH2AX蓄积增加，磷酸化激活Chk1; SOMCL-9112单用不会引起尤文氏瘤细胞中PARP1蛋白与染色质结合，但是可促进单链DNA结合蛋白RPA32在染色质上聚集。SOMCL-9112导致尤文氏瘤细胞产生明显的S期阻滞，并最终导致细胞凋亡。 我们采用连续递增药物浓度的方式，经过2～3月，建立了SK-ES-1和RD-ES细胞对SOMCL-9112的耐药细胞SK-ES-1/SP和RD-ES/SP，并进行耐药克隆挑选，建成相应耐药株。SK-ES-1/SP和RD-ES/SP对SOMCL-9112的耐药性达200倍以上;体外无药连续培养6个月，依然维持其耐药程度，表明其耐药性稳定。与亲本细胞相比，耐药细胞，特别是SK-ES-1/SP形态、贴壁能力明显变化，但生长速度变化不明显;耐药细胞株SK-ES-1/SP-1和RD-ES/SP-1的迁移能力也明显增强。 为考察耐药细胞SK-ES-1/SP和RD-ES/SP对其它PARP抑制剂的交叉耐药性及其程度，我们评价了已批准上市PARP抑制剂Olaparib和正在进行Ⅲ期临床试验的同类药物BMN673和AG014699在耐药细胞和相应亲本细胞的增殖生长抑制作用。结果显示，两株耐药细胞对三种受试PARP抑制剂具有不同程度的交叉耐药性，耐药倍数在2.99至31.30倍之间。特别值得注意的是，两株耐药细胞对PARP抑制活性最强的药物BMN673交叉耐药程度最高，而对PARP抑制活性最弱的药物Olaparib交叉耐药程度最低，提示其交叉耐药性与PARP抑制剂抑制PARP1酶活性的程度可能存在相关性，但其机制尚待阐明。 尤文氏瘤临床治疗常用药物包括阿霉素、更生霉素（放线菌素D）、长春新碱、依托泊苷等经典化疗药物;而且临床在研PARP抑制剂常与替莫唑胺、铂类、伊立替康（有效成分为SN38）、紫杉醇、吉西他滨等联合应用。因此，我们迸一步考察了耐药细胞SK-ES-1/SP和RD-ES/SP对上述化疗药物的交叉耐药性及其程度。结果显示在两株耐药细胞中，拓扑异构酶Ⅰ抑制剂SN38和微管抑制剂紫杉醇的敏感性轻微降低，耐药倍数为1.23～2.51倍之间;而抑制RNA多聚酶的转录抑制剂放线菌素D则一致性地敏感性轻微增加，增加约1.37～3.45倍;其余药物的敏感性则在两株耐药细胞表现不一，但变化幅度均很小，耐药倍数范围在0.36～2.17倍之间。该结果显示，SOMCL-9112的尤文氏瘤耐药细胞对上述受试药物交叉耐药性不明显;即使耐药，程度也很轻;而且对尤文氏瘤常用治疗药物放线菌素D的敏感性可能还略有增加。 初步的耐药机制研究显示，SOMCL-9112尤文氏瘤耐药细胞的PARP1蛋白表达水平无明显变化;SOMCL-9112抑制亲本和耐药细胞PARP酶活性和捕获PARP1-DNA复合物的程度相当;SOMCL-9112也未诱导药物转运蛋白P-糖蛋白的表达。然而在耐药细胞中，SOMCL-9112诱导γH2AX蓄积明显减少，即使10μM的SOMCL-9112持续处理24 h，耐药细胞中也几乎不能检测出γH2AX，表明SOMCL-9112在耐药细胞中诱导的DNA双链断裂损伤蓄积明显减少。与此一致的是，SOMCL-9112在耐药细胞中诱导细胞周期检查点蛋白Chk1的磷酸化水平降低，S期阻滞减弱，细胞凋亡明显减少。这些结果提示SOMCL-9112诱导的尤文氏瘤细胞耐药，与其对主要作用靶点PARP1的抑制作用似乎无关，而可能与耐药细胞中DNA修复能力增强、导致致死性双链断裂DNA蓄积减少有关。为深入研究其中的相关机制和便于比较分析，我们进一步采用TALEN技术建立了PARP1表达缺陷的尤文氏瘤SK-ES-1（PARP1-/-）和RD-ES（PARP1-/-）细胞，发现PARP1表达缺陷导致细胞对SOMCL-9112明显耐药。该结果表明PARP1是SOMCL-9112在尤文氏瘤细胞发挥增殖生长抑制作用所必需，并进一步强调了SOMCL-9112诱导的尤文氏瘤细胞耐药与增强细胞的DNA修复能力可能的相关性。 FOXO1是一种抑癌蛋白，受尤文氏瘤融合基因EWS-FLI1负调控。我们发现SOMCL-9112的尤文氏瘤耐药细胞的FOXO1蛋白水平明显下降，但其与SOMCL-9112耐药的相关性有待进一步研究。此外，在SOMCL-9112耐药的SK-ES-1/SP细胞中，我们还发现胰岛素样生长因子1型受体IGF1R表达显著减少，且该耐药细胞对IGF1R抑制剂AEW541和OSI906明显耐药，耐药倍数分别为5.16和63.36。然而，同样现象并未在SOMCL-9112耐药的RD-ES/SP细胞中观察到。因此IGF1R表达的减少可能与SOMCL-9112耐药性缺乏直接相关性。 综上，本论文阐明了新型PARP抑制剂SOMCL-9112对尤文氏瘤细胞的增殖生长抑制作用和初步机制，建立了2株不同尤文氏瘤细胞对SOMCL-9112的耐药株并阐明其耐药特性和初步的耐药机制。该项工作为进一步深入研究SOMCL-9112的耐药机制、探索影响尤文氏瘤对PARP抑制剂敏感性的因素、发现克服其耐药性的措施奠定基础。