论文部分内容阅读
非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染猪引起的一种急性、高度致死性传染病。2018年ASF在我国沈阳首次爆发,随后迅速蔓延至全国,给养猪业造成严重的经济损失,被列为一类动物疫病。目前,尚无有效的疫苗用于防控非洲猪瘟。随着ASFV在我国猪群中的流行,ASF主要发病方式由大规模爆发向零星散发转变,ASFV弱毒株分离越来越多。弱毒株的流行,需要更灵敏的血清学抗体检测方法予以诊断。由于ASFV编码蛋白众多,病毒抗原反应复杂。本研究通过原核表达病毒主要结构蛋白和高表达量蛋白,以ASFV阳性猪血清筛选出病毒的优势抗原,并以优势抗原蛋白作为包被抗原建立检测ASFV抗体的间接ELISA方法,为ASFV诊断提供了技术支撑,同时也为相关疫苗的研发提供评估手段。本研究根据非洲猪瘟病毒粒子蛋白组学分析和病毒感染细胞蛋白组学分析,确定病毒16种高表达蛋白和32种主要结构蛋白作为筛选抗原。依据我国流行的GII ASFV株基因组序列,确定分析抗原的基因序列,并使用Protean软件分析ASFV相关蛋白抗原性、TMHMM-2.0软件分析其跨膜区,从而选取优势抗原片段,利用大肠杆菌密码子优化系统优化基因序列。使用Primer 5.0软件设计引物,进行PCR扩增,扩增出的目的片段连接到p Cold-I载体上,鉴定测序结果显示,成功构建出p Cold-I-p30、p54。委托生物公司合成了KP177R、K205R、EP153R、CD2V、A104R、p72等46个病毒基因序列,并克隆至p Cold-I载体上。对48个重组质粒进行诱导表达,超声后表达在沉淀中用包涵体的方法进行纯化,超声后表达在上清中,用Ni+亲和层析的方法进行纯化。经过SDS-PAGE分析最终成功纯化出36种靶蛋白。以纯化的36种靶蛋白为包被抗原,通过间接ELISA平行比较不同抗体水平下的阴/阳性血清,OD450nm进行读值,根据阳性孔（P）/阴性孔（N）的比值,进行结果判定,筛选出优势抗原。其中有3种抗原在所有阳性血清中均呈强阳性反应,17种抗原在部分阳性血清中呈强阳性反应,3种抗原在部分阳性血清中呈弱阳性反应,13种抗原在所有阳性血清中均呈阴性反应,所有的抗原在阴性血清中均未发生反应,经过评定,筛选出p30为最佳优势抗原。以上结果表明成功构建了ASFV 48个基因的原核表达质粒并成功纯化出36种靶蛋白,确定p30为最佳优势抗原。根据以上结果,我们基于非洲猪瘟病毒p30蛋白建立间接ELISA抗体检测方法。首先以纯化出的ASFV p30蛋白为包被抗原,包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳的优化条件,OD450nm进行读值,根据阳性孔（P）/阴性孔（N）的比值,进行结果判定,实验结果显示,最佳抗原包被浓度为20 ng/孔,血清稀释度在1:40时,效果最佳。进一步优化时,当用碳酸盐包被液包被,5%脱脂乳37℃封闭1h时,效果最佳。最佳的包被温度及时间为37℃1 h,酶标二抗的最佳稀释倍数为1:10000,血清与二抗最佳作用的时间均为1 h,最佳显色的温度与时间为室温（21℃-25℃）10 min。基于上述试验所优化的最佳条件进行实验,对24份已知背景的ASFV标准阴性血清样品进行了检测,根据统计学原理,确定间接ELISA抗体检测方法的判定域值:阴性值应≤0.244,阳性值应≥0.294,两者之间为可疑。特异性试验中,该方法与PRRSV、SIV、PRV、PEDV、CSFV、PDCOV的标准阳性血清均无交叉反应,表明该方法特异性良好。敏感性试验中,该方法在阳性血清稀释到1:1280时,呈现阳性反应,表明该方法敏感性良好。通过建立的间接ELISA抗体检测方法检测180份田间临床样本,并与商品化的非洲猪瘟检测试剂盒进行对比,结果显示符合率能达到98.3%。综上所述,本研究运用原核表达系统,成功构建了ASFV 48个基因的原核表达质粒并成功纯化出36种靶蛋白,经过筛选,鉴定出ASFV感染的优势抗原:p30、p54、KP177R为优势抗原,其中p30蛋白为最佳优势抗原。并基于ASFV p30蛋白构建间接ELISA抗体检测方法,具有良好的特异性、灵敏性。这为我国ASFV防控提供了重要的技术支撑,同时为我国ASFV疫苗和血清诊断技术研发提供了理论依据。