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第一部分：rAAV1-9对人脐带血晚期内皮祖细胞的转导效率的研究目的：观察rAAV1-9对人脐带血晚期内皮祖细胞(HUCB-late EPCs)的转导效率,筛选合适的重组腺相关病毒血清型作为携带CXCR4基因的载体。方法：1.用PEI介导表达绿色荧光蛋白(GFP)的rAAV包装系统(pAAV-CMV-GFP, pAAV-RC1-9和pHelper)转染HEK293细胞分离获得不同血清型表达绿色荧光蛋白(GFP)的rAAV-GFP,浓缩纯化病毒,以SDS-PAGE法检测病毒纯度和qPCR法测定病毒滴度。根据实验结果,选择转导效率最高的重组腺相关病毒血清型作为携带CXCR4基因的载体,以同样的方法获取rAAV-CXCR4;2.密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞(MNCs),将其诱导培养为EPCs,连续培养4周获得晚期内皮祖细胞(late endothelial progenitor cells late EPCs);3.将late EPCs种植到24孔板中(每孔1×104个),加入浓缩、纯化后的重组腺相关病毒(rAAV,至rAAV9),感染复数(multiplicity of infectionMOI)为100,000 viral genomes/cell,每种血清型病毒重复3次；用ImagePro Plus6.0图像分析软件计算不同感染时间(6h,12h,18h,24h, 30h,36 h)表达GFP的EPCs比例,计算转导效率。结果：1.成功构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的rAAV血清型(rAAV1-9-GFP),经纯化浓缩后病毒的滴度均超过2.0 ×109vg/μl, rAAV6-CXCR4的滴度为2.88×109vg/μl。2.人脐带血单个核细胞(MNCs)经过诱导培养4周后,经形态学、细胞表面标记及生物学特征鉴定为late EPCs。3. rAAV1-9对Late EPCs的转导效率存在明显差异,rAAV6的转导效率最高(0.5208±0.0147), rAAV2次之(0.4506±0.011),rAAV4的转导效率最低(0.1382±0.0102),P<0.05。第二部分：CXCR4基因过表达HUCB-late EPCs移植对大鼠后肢缺血组织血管新生的影响目的：1.观察转染rAAV6-CXCR4和rAAV6-GFP后,HUCB-late EPCs的体外成血管能力。2.观察CXCR4基因过表达HUCB-late EPCs移植对大鼠后肢缺血组织血管新生的影响。方法：1.用rAAV6-CXCR4、rAAV6-GFP感染人脐带血late EPCs, Western Blot检测CXCR4蛋白表达水平。2.设立rAAV6-CXCR4感染组、rAAV6-GFP感染组和空白组,应用基质胶成血管实验检测转染后细胞的体外成血管能力。3.构建SD大鼠后肢缺血模型。6周龄雄性SD大鼠18只,SD大鼠称重后,腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉。以一侧股动脉及分支结扎、离断的方法构建后肢缺血模型。4.随机分为实验组、对照组、空白组,每组6只。实验组缺血后肢肌内直接注射500 μ1含1×106个CXCR4过表达内皮祖细胞的EGM-2、对照组缺血后肢肌内直接注射500 μ1含1×106个内皮祖细胞的EGM-2、空白对照组缺血后肢肌内直接注射500μlEGM-2o28天后,脱颈法处死动物,立即取缺血后肢腓肠肌,放入10倍体积的4%多聚甲醛固定。5.HE染色检测缺血后肢肌肉间、肌肉旁微小血管情况；免疫组织化学染色检测肌肉间、肌肉旁新生血管CD31阳性内皮细胞的表达情况,并计算CD31阳性新生微血管数量。结果：1. rAAV6-CXCR4感染组HUCB-late EPCs中CXCR4蛋白的表达高于rAAV6-GFP感染组和对照组。2.3组均在基质胶上成功形成管腔样结构,单位面积基质胶形成的管腔面积分别为0.531+0.023mm2、0.514+0.026mm2、0.523+0.021mm2, rAAV6-CXCR4、rAAV6-GFP感染对late EPCs的体外成血管能力无影响(>0.05)。3.与空白组比较对照组和实验组CD31+表达的新生微血管明显增多,实验组新生微血管表达数量较对照组多(P<0.05),分别为：肌肉间(2.32±0.90、5.18±0.86、8.39±0.91)；肌肉旁(5.32±0.93、8.12±0.95、12.45±1.01)。结论：1.9种不同血清型rAAV对人脐带血Late EPCs的转导效率存在明显差异,其中rAAV6的转导效率最高、rAAV2次之、rAAV4最低。2. CXCR4过表达可以促进人脐带血late EPCs在SD大鼠后肢缺血组织新生微血管的形成。