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研究目的1.运用网络药理学方法预测青蒿琥酯治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点;2.使用分子对接技术考察青蒿琥酯单体分子与网络药理学所预测靶点的结合情况,进一步筛选出既在药物-靶点-疾病网络中起到关键作用,又能够与青蒿琥酯分子进行良好活性结合的靶点;3.考察青蒿琥酯对3%DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型的药效;4.验证网络药理学和分子对接技术筛选出的关键靶点在溃疡性结肠炎小鼠结肠的表达并研究青蒿琥酯对其影响;5.以筛选出的TP53靶点为切入点,从细胞凋亡的角度初步探讨溃疡性结肠炎的发病机制与青蒿琥酯治疗溃疡性结肠炎的潜在作用机制。研究方法1.本研究通过 ChEMBL 数据库、Swiss Target Prediction 数据库、Target-Prediction数据库、PharmMapper在线服务器初步预测青蒿琥酯药物单体的潜在靶点,同时利用数据库、文本挖掘工具和GEO芯片分析初步检索溃疡性结肠炎的疾病靶点,再分别构建青蒿琥酯和溃疡性结肠炎靶点的蛋白互作（PPI）网络并对其进行聚类分析,得到青蒿琥酯药物关键靶点和溃疡性结肠炎疾病关键靶点。进一步将青蒿琥酯药物关键靶点和溃疡性结肠炎疾病关键靶点交集得到青蒿琥酯治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点并构建其PPI网络,最后对网络进行基因功能分析（GO Analysis）和通路富集分析以初步探讨青蒿琥酯治疗溃疡性结肠炎的潜在药效机制。2.利用DrugBank数据库获取青蒿琥酯单体分子作为对接配体并记录其结构信息,再从PDB数据库中查找网络药理学部分筛选出的青蒿琥酯治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点,获取合适的靶点蛋白作为对接受体,利用POCOSA1.1在线蛋白活性位点预测系统预测靶蛋白的活性口袋,进一步使用AutoDockTools软件完成配体、受体的准备和相关参数设置并利用Autodock4.0软件完成青蒿琥酯和靶蛋白的分子对接及二次对接。进一步利用Pymol软件完成结果的可视化展示,并利用Ligplot+软件对生成的配体-受体复合物进行氢键和疏水作用的分析,最后整合网络药理学筛选出的靶点信息,得到既在药物-靶点-疾病网络中起到关键作用,又能够与青蒿琥酯单体分子进行良好活性结合的靶点,以备进一步动物实验验证。3.动物实验将72只小鼠随机平均分为1个正常对照组和5个实验组（n=12）:模型组（0.01ml/g/d生理盐水灌胃）、阳性对照组（柳氮磺吡啶200mg/kg/d）、青蒿琥酯低剂量组（ART 75 mg/kg/d）、青蒿琥酯中剂量组（ART 150mg/kg/d）和青蒿琥酯高剂量组（ART 300 mg/kg/d）,实验组采用3%DSS溶液自由饮用7天制备溃疡性结肠炎模型。所有组别从3%DSS造模液初次供给后8小时开始灌胃给药,连续给药7天,期间观察记录各组小鼠的一般情况、体重变化、粪便形状及大便隐血情况并进行疾病活动指数（DAI）的测定评分。造模及给药结束后于实验第8天采用颈椎脱臼法处死小鼠并取其完整的结肠组织,记录结肠长度并进一步完成结肠病理切片的制备及病理组织学观察和病理评分,以初步判断青蒿琥酯对溃疡性结肠炎的药效。4.采用Western-Blot法和RT-qPCR法从蛋白和mRNA表达层面验证网络药理学和分子对接部分筛选出的3个关键靶点:IL-6、TP53、VEGFA在正常小鼠和溃疡性结肠炎小鼠间的表达差异并检测青蒿琥酯对其表达的影响。5.采用RT-qPCR法检测p53信号通路中TP53、Bax、Bcl-2等关键靶点的mRNA表达量,同时利用免疫组化法检测溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜组织中Caspase-3的表达以探讨青蒿琥酯治疗溃疡性结肠炎的药效机制。研究结果1.运用网络药理学方法筛选出了 1 54个青蒿琥酯药物靶点和2104个溃疡性结肠疾病靶点,将靶点进行PPI网络构建后得到137个药物关键靶点和1423个疾病关键靶点,进一步将药物关键靶点与疾病关键靶点进行交集后,筛选出了 IL6、VEGFA、TP53、CCND1、CTNNB1等22个青蒿琥酯治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点,靶点涉及到的基因功能有细胞外区调节、外泌体调节、细胞增殖调节、细胞凋亡调节、小分子代谢和对免疫系统的调节等,涉及到的通路含有P53信号通路、WNT信号通路、JAK/STAT信号通路等。2.分子对接结果显示青蒿琥酯与利用网络药理学方法筛选出的22个关键靶点蛋白受体中的20个完成了对接。20个靶点中除MS4A1靶蛋白外都与青蒿琥酯完成了活性口袋处的对接,进一步将对应的19个配体-受体复合物的最优构象拆解并进行二次对接后,结果显示19个受体-配体复合物RMSD值均小于2.0（?）。在形成的19个口袋最优构象配体-受体复合物中,结合能最低的前5个靶蛋白受体分别为AKR1B1（-11.63 kcal/mol）、GZMB（-11.52 kcal/mol）、TP53（-11.27 kcal/mol）、IL6（-10.74 k cal/mol）和LDHB（-10.68 kcal/mol）,对形成的19个口袋最优构象分别分析,结果表明19个配体-受体复合物中结合部位都存在氢键作用和疏水作用,青蒿琥酯分子末端羧基（-COOH）上的氧原子为其主要的氢键供体,其与19个靶点中的18个（TP53、IL6、VEGFA、GZMB、MMP2、CCND1、LYN、ANXA5、CTNNB1、ESR1、CD 2、GALM、TF、RBKS、IFNGR1、PCNA、SRM、LDHB）的末端氨基酸残基形成了氢键作用;与青蒿琥酯分子形成最多氢键的靶点为IL6和LDHB。进一步整合网络药理学的靶点信息后得到既在药物-靶点-疾病网络中起到关键作用,又能够与青蒿琥酯单体分子进行良好活性结合的靶点:IL6、TP53与VEGFA。3.本实验采用3%的DSS溶液（MW 36000-50000）自由饮用法成功制备了 C57小鼠的溃疡性结肠炎动物模型,模型组小鼠在体重变化、结肠长度、DAI以及病理评分方面都与正常对照组小鼠有显著的差别（P<0.01）,实验第8天柳氮磺吡啶、低剂量青蒿琥酯组小鼠体重相较于模型组显著升高（P<0.01）,结肠长度较长（P<0.01）,DAI显著降低（P<0.01）;中剂量青蒿琥酯组小鼠体重相较于模型组有所升高（P<0.05）,结肠长度较长（P<0.05）,DAI降低（P<0.05）;而高剂量青蒿琥酯组小鼠体重、结肠长度、DAI相较于模型组小鼠无显著差异（P>0.05）。小鼠结肠组织HI评分显示,相较DSS模型组（8.42±1.08）,柳氮磺吡啶组小鼠的结肠HI评分（5.42±1.83）和青蒿琥酯低剂量组小鼠的结肠HI评分（5.67±1.87）均显著降低（P<0.01）;青蒿琥酯中剂量组小鼠的结肠HI评分相较于模型组也有所降低（P<0.05）;青蒿琥酯高剂量组小鼠的结肠HI评分与模型组比较无统计学差异（P>0.05）。4.相较于正常组小鼠,在蛋白层面,3%DSS模型组的TP53、VEGFA蛋白表达量显著降低（P<0.05）,IL6的蛋白表达量显著升高（P<0.05）。经柳氮磺吡啶（200mg/kg/d）、低剂量青蒿琥酯（75 mg/kg/d）给药治疗后,小鼠结肠组织TP53、VEGFA表达量相较于模型组显著升高（P<0.05）,IL6的蛋白表达量显著降低（P<0.05）;经中剂量青蒿琥酯（150 mg/kg/d）给药治疗后,TP53、VEGFA表达量相较于模型组显著升高（P<0.05）,而IL6表达量相较于模型组未见统计学差异;经高剂量青蒿琥酯（300 mg/kg/d）给药治疗后,VEGFA表达量相较于模型组显著升高（P<0.05）,而TP53、IL6表达量相较于模型组未见统计学差异。在基因表达层面,模型组小鼠结肠TP53、VEGFA mRNA表达量显著降低（P<0.01）,IL6 mRNA表达量显著升高（P<0.01）;相较于模型组小鼠,柳氮磺吡啶组、青蒿琥酯低剂量组小鼠结肠TP53、VEGFA mRNA表达量显著增多（P<0.01）,IL6 mRNA表达量显著减少（P<0.01）,青蒿琥酯中剂量组小鼠结肠TP53、VEGFA mRNA表达量增多（P<0.05）,IL6 mRNA表达量减少（P<0.05）,青蒿琥酯高剂量组的小鼠结肠TP53、VEGFA、IL6 mRNA表达与模型组比较未见统计学差异（P>0.05）。5.相较于正常组小鼠,模型组小鼠结肠Bax mRNA表达量显著降低（P<0.01）,Bcl-2 mRNA表达量显著升高（P<0.01）;相较于模型组小鼠,柳氮磺吡啶组、青蒿琥酯低剂量组小鼠结肠Bax mRNA表达量显著增多（P<0.01）,Bcl-2 mRNA表达量显著减少（P<0.01）,青蒿琥酯中剂量组小鼠结肠Bax mRNA表达量增多（P<0.05）,Bcl-2 mRNA表达量减少（P<0.05）,青蒿琥酯高剂量组的小鼠结肠Bax、Bcl-2 mRN A表达与模型组比较未见统计学差异（P>0.05）。进一步对小鼠结肠黏膜Caspase-3表达的检测结果显示,相较于正常组大鼠,3%DSS模型组结肠黏膜的Caspase-3表达量显著降低（P<0.01）,经柳氮磺吡啶、低剂量青蒿琥酯、中剂量青蒿琥酯给药治疗后,小鼠结肠黏膜的Caspase-3表达量相较于模型组均有显著升高（P<0.01）,而青蒿琥酯高剂量组的小鼠结肠黏膜的Caspase-3表达与模型组比较未见统计学差异（P>0.05）。结论1.网络药理学研究得到的靶点预测结果提示了青蒿琥酯多靶点、多通路的药效机制,并预测了其可能通过IL6、VEGFA、TP53、CCND1、CTNNB1等靶点和细胞外区调节、外泌体调节、细胞增殖调节、细胞凋亡的调节、小分子代谢及对免疫系统的调节等调节机制来减缓溃疡性结肠炎相关的炎症反应和局部组织损伤。2.分子对接的结果显示青蒿琥酯可与AKR1B1、GZMB、TP53、IL6、LDHB等靶点形成良好的活性结合,进一步证实了青蒿琥酯多靶点的作用机制。结合网络药理学研究的信息,提示青蒿琥酯可能通过IL6、TP53、VEGFA等关键靶点及其相关的免疫-炎症、细胞凋亡和黏膜保护机制来治疗溃疡性结肠炎。3.动物实验结果显示低剂量和中剂量青蒿琥酯可有效缓解3%DSS所造成的小鼠结肠炎症和损伤,其机制可能与下调IL6、上调TP53、VEGFA靶点的表达有关。4.进一步以TP53靶点为切入点的研究表明,青蒿琥酯可通过靶向TP53,上调Bax表达,下降Bcl-2表达,使下游Caspase-3表达增加,进而增进p53通路相关的局部炎性细胞的凋亡这一机制发挥药效。