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肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,由于其高发病率及高死亡率,成为影响人类健康的最大威胁,据统计,目前我国肝癌发病人数占全球的55%,而死亡人数约占全世界肝癌死亡人数的45%[1]。因此,肝癌的治疗成为我国医药工作者迫切需要攻克的难题。穿心莲内酯(andrographolide)系自爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm. f)Nees中提取得到的二萜内酯类化合物,是中药穿心莲的主要有效成分之一,具有清热、解毒、凉血、消肿等功能。现代研究表明,穿心莲内酯具有抗肿瘤和免疫调节等方面的活性,在治疗胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤上效果明显,使其成为近年来在治疗癌症方面较有发展前途的药物。相关研究表明,穿心莲内酯具有较明显的抗肝癌活性,但给药后穿心莲内酯主要分布于肾脏,肝靶向不明显,这在很大程度上影响了其抗肝癌作用的发挥；另一方面,穿心莲内酯属于二萜内酯类,结构不稳定,易受外界环境(温度、pH值)的影响阳]。针对上述问题,研究和开发-种能够增强穿心莲内酯肝靶向性、提高其稳定性的药物传递系统,具有十分重要的临床指导意义。类脂质囊泡(Non-ionic surfactant vesicle, Niosome,以下简称囊泡)是一种优良的药物载体,其以各种非离子表面活性剂为载体材料,在水合介质中通过自身闭合形成的双分子层囊泡状载体。囊泡具有类似生物膜结构的双分子层膜,与细胞膜有高度亲和性,可促进药物跨膜转运；囊泡包裹药物后,一方面可以减少药物在达到作用部位前被破坏,增加药物稳定性,同时药物透过双分子层向外扩散,呈现缓慢释放规律,另一方面通过控制囊泡粒径实现被动靶向,改变药物的体内分布,在人体内主要被网状内皮系统吞噬,增加药物对肝、脾、肺和骨髓等组织的靶向性,达到增效减毒的作用,是靶向给药系统研究的良好载体。针对穿心莲内酯肝靶向性不明显、稳定性差等缺陷,将其制成囊泡,使穿心莲内酯富集于肝脏,缓慢释药,从而很好地发挥抗肝癌作用。本文系统地考察了穿心莲内酯的理化性质、穿心莲内酯囊泡的制备工艺、质量标准、组织分布特点及体外抗肝癌活性等,主要研究内容及结果如下：(1)对穿心莲内酯的相关理化性质进行了考察,为穿心莲内酯囊泡的研制奠定基础。结果如下,穿心莲内酯的油水分配系数为1.42；在各有机溶剂中穿心莲内酯溶解度大小依次为甲醇(13.54mg·mL-1)、丙二醇(9.84mg·mL-1)、无水乙醇(8.02mg·mL-1)、正辛醇(1.36mg·mL-1)、三氯甲烷(0.36mg·mL-1)；在不同pH值磷酸盐缓冲液中穿心莲内酯的溶解度在20-70μg·mL-1范围内；25℃各pH值下穿心莲内酯96小时内含量变化较小,但pH9.4下累积降解了15%左右；80℃各pH值下穿心莲内酯24小时内降解均较明显：穿心莲内酯在20%丙二醇生理盐水溶液中随温度的升高,含量有一定程度地减少。以上试验结果显示,穿心莲内酯呈脂溶性,略溶于甲醇、无水乙醇、丙二醇,极微溶于三氯甲烷,在水中几乎不溶；穿心莲内酯在25℃下稳定,在80℃下稳定性较差；在20%丙二醇生理盐水溶液中温度对其有一定的影响。(2)穿心莲内酯囊泡制备工艺研究。主要包括处方因素优化、工艺条件优化、超声工艺优化等方面。通过单因素试验与正交试验得到穿心莲内酯囊泡最佳制备条件为：采用薄膜分散法制备囊泡,司盘60用量50mg(81.50%),胆固醇用量7.35mg(10.35%),穿心莲内酯用量5mg(8.15%),加有机溶剂溶解,混合均匀,置茄形瓶中混匀,减压除去有机溶剂(50℃,100r·min-1,-0.1Mpa,1h),在瓶壁上形成-层薄膜,加20%丙二醇生理盐水溶液10mL,玻璃球5粒,于45℃下旋转水合(125r·min-1)50min,冰水浴冷却,得穿心莲内酯囊泡混悬液,采用细胞超声破碎仪对其超声处理(100W)10次,5秒／次,即可。按以上最佳工艺条件制备的穿心莲内酯囊泡包封率高(72.36%)、载药量大(5.90%)、分散性良好,粒径符合肝靶向要求,且工艺条件稳定、合理、可行。(3)穿心莲内酯囊泡质量评价。结果表明,穿心莲内酯囊泡多为球形及类球形粒子,外观圆整,大小较均一,表面光滑、分散性良好,粒径主要分布在400nm以下范围内,平均粒径为206nm,包封率为72.36%,载药量为5.90%,pH值为8.47,4℃下囊泡稳定,24小时囊泡中药物累积释放度为65%,符合Higuchi动力学方程。分别采用红外光谱法(IR)和差示量热分析法(DSC)对穿心莲内酯囊泡形成进行了鉴定。红外光谱图显示,穿心莲内酯囊泡与原辅料相比有较大差别,穿心莲内酯囊泡指纹区产生了两个强而宽的新吸收峰,穿心莲内酯12,13位双键振动吸收峰1646.94cm-1消失,差示量热分析图谱显示,与原辅料比较,穿心莲内酯囊泡形成了两个吸热峰,且单位吸热量明显减小。从红外光谱图和差示量热分析图可推测囊泡结构已经形成,穿心莲内酯被顺利包入囊泡内。(4)穿心莲内酯囊泡小鼠体内组织分布研究。首先对囊泡组与溶液组在小鼠体内组织分布数据及药-时曲线图进行了分析,然后运用DAS2.1.1药动学软件进行拟合,确定两给药组中每种器官最佳房室模型,并求算出相关药动学参数AUC(0→∞)、Cmax和MRT(0→∞)及靶向评价参数Te与Ce。结果显示,两给药组中的每种器官最佳房室模型为二室开放模型(C=Ae-αt+Be-βt),肝靶向效率Te穿心莲内酯囊泡为3.66,穿心莲内酯溶液为0.62,肝峰浓度之比Ce为2.45,穿心莲内酯囊泡与穿心莲内酯溶液相比,MRT(0-∞)明显增大。以上结果表明,与穿心莲内酯溶液相比,穿心莲内酯囊泡具有明显的肝靶向性及较好的缓释作用。(5)穿心莲内酯囊泡体外抗肝癌细胞实验研究。通过MTT法考察了穿心莲内酯囊泡对HepG2肝癌细胞存活率的影响,结果显示,其能明显降低HepG2肝癌细胞存活率(n=6,P<0.01),空白囊泡对HepG2肝癌细胞存活率基本无影响；通过荧光定量RT-PCR法检测了穿心莲内酯囊泡对细胞Be1-2mRNA和Bax mRNA两种基因表达的影响,结果显示,穿心莲内酯囊泡能明显提高HepG2肝癌细胞中Bax mRNA表达量,降低Be1-2mRNA的表达量,降低Bel-2/Bax比值,空白囊泡组对细胞Be1-2mRNA和Bax mRNA两种基因的表达影响不明显。以上结果表明,穿心莲内酯囊泡对HepG2肝癌细胞具有较好的抑制作用。综上所述,本文采用薄膜分散法,成功研制了穿心莲内酯囊泡,制备工艺条件稳定可行、重现性良好,穿心莲内酯囊泡质量稳定可控,具有较明显的肝靶向性及较好的缓释作用,抗肝癌活性明显,达到了研究目的,为治疗肝癌药物的开发奠定了良好的实验基础。本文在制备穿心莲内酯囊泡的过程中,展开了以下几方面的探索与研究,并且获得了良好的效果。1.针对穿心莲内酯肝靶向性不明显、稳定性差等不足,首次成功研制了穿心莲内酯囊泡。本文研制的穿心莲内酯囊泡质量稳定可控、包封率较高(72.36%)、载药量较大(5.90%),具有较明显的肝靶向作用和较好的缓释作用,为治疗肝癌药物的开发提供了一种新的思路和方法。2.对中药囊泡研制中水合介质的选择进行了有益的探索。实验研究中,结合囊泡形成条件与穿心莲内酯的溶解特性,探索性地选用20%丙二醇生理盐水溶液作为水合介质,能最大程度的将穿心莲内酯包入囊泡内,提高了囊泡对药物的包封率与载药量。