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研究背景自1980年至今,全球肥胖患病率已增长约2倍,全世界目前约有19亿人口患有超重及肥胖。随着社会和经济的发展,肥胖及其相关疾病例如糖尿病和心脑血管疾病等也越发成为威胁中国人群健康的重要疾病。由肥胖所引发的个人健康问题对人口、社会、医疗、经济等诸多方面均造成了难以承受的负担,其已成为21世纪全世界人类所面临的最为严峻的公共卫生问题之一,发现并研制一种安全有效的肥胖治疗方法已迫在眉睫。目前针对肥胖的治疗方法主要包括节食、运动、手术和药物。其中,外科手术大多通过缩小胃容积并刺激迷走神经反射,造成模拟进食后的饱腹感,用以减少食物摄入。尽管手术治疗的效果立杆见影,但其对人体造成的永久性损伤也是显而易见的。除手术之外,药物治疗也是一种选择,其治疗的核心法则是人为地促使能量摄入减少和/或能量消耗增加,从而负向调控能量平衡。然而尽管肥胖治疗方案层出不穷,但多数患者往往只能一过性地减轻体重,并不能长久地保持。其主要因为人体内管理饱腹感和饥饿感的摄食神经中枢与管理享乐行为的奖励中心,在结构和功能上紧密关联,使得进食常常与快乐体验协同发生。并且,这种协同作用又与情绪和认知功能密切相关。这就使得患者对于肥胖的坚持往往是出自于一种本能的、生理性的坚持,也就导致肥胖治疗变得十分困难。肠道承担着生物体内外环境物质交换的重要职责,肠道微生物在促进糖、脂代谢功能和维持机体能量平衡中发挥重要作用,越来越多的证据显示肠道内环境失调、肠道微生物多样性锐减与肥胖和其他代谢性疾病的发生存在密切关联。另一方面,菌群移植研究结果却发现体重正常供体的肠道菌群具有抵抗高能量饮食所致肥胖的作用,使得通过饮食或药物手段逆转并改善肠道内环境稳态成为肥胖治疗的潜在途径。近年来,包括白藜芦醇、槲皮素、穿心莲内酯和黄连素在内的多种来源于天然植物的生物分子被证实具有较好的控制代谢性疾病的良好作用,并且它们通常具有成分单一和结构明确的特点,为基础研究和临床试验提供了便利。雷公藤红素是中药雷公藤的一种纯化提取物,具有很强的抗氧化作用,在抗癌症血管生成中应用广泛。此前研究报道,雷公藤红素可抑制肥胖小鼠食欲并激活脂肪和肌肉组织能量代谢通路增加能量消耗从而抵抗高脂饮食的不利影响,使其作为一种潜在高效的肥胖治疗药物进入大众视野。但是,关于雷公藤红素发挥肥胖治疗作用的有效剂量、给药方式和起效时间方面尚存在巨大争议,其是否对肠道微生物产生影响亦不甚明确。因此,本研究以高脂饮食诱导肥胖大鼠作为模型,通过鉴定大鼠体重、摄食和能量代谢等表型,结合高通量测序和基因编辑技术手段,旨在验证雷公藤红素的肥胖治疗作用,探索雷公藤红素发挥肥胖治疗作用的可能机制,明确肠道菌群在其中扮演的角色。研究方法首先,我们以雄性ICR小鼠为模型,一次性灌胃给予小鼠0~62.5 mg/kg剂量的雷公藤红素处理,连续5天观察小鼠体重、进食、精神等一般状况,依据不同物种药物等效换算方法,明确大鼠实验中雷公藤红素的安全剂量范围。其后,我们通过60%高脂饮食诱导方式,对9周龄SD大鼠进行肥胖造模,并在20周龄时选择具有肥胖表型的大鼠作为实验对象。我们分别以腹腔注射和灌胃的方式,连续21天给予大鼠溶剂对照、15μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg和500μg/kg剂量的雷公藤红素处理,记录大鼠体重和摄食情况,结合血生化指标、腹部白色脂肪和肝脏组织H&E染色切片、口服葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验结果,综合判断雷公藤红素发挥肥胖治疗作用的有效剂量。之后,我们分别采集溶剂对照组和雷公藤红素组大鼠不同处理时间的粪便,无菌条件下提取菌群基因组DNA,对V3区进行16s rRNA测序,利用Qiime软件和R:Phyloseq软件包,分析两组大鼠肠道菌群多样性和菌群相对丰度的差异。在此基础上,我们向大鼠饮用水中添加新霉素、青链霉素、万古霉素和甲硝唑的抗生素合剂,对大鼠肠道菌群进行干扰,并观察该条件下雷公藤红素对大鼠体重影响的变化,确认肠道菌群在雷公藤红素治疗肥胖过程中发挥的作用。通过收集对照组和处理组大鼠下丘脑组织,我们提取RNA并进行转录组测序,利用SAMtools、HTSeq和R:DESeq2软件分析表达存在差异的基因,并采用IPA软件研究差异基因富集的生物学通路。我们以利用Crispr-Cas9技术取得的关键通路基因敲除SD大鼠为模型,给予雷公藤红素处理,观察大鼠肥胖表型,探索雷公藤红素对下丘脑能量调节中枢关键基因通路的影响。最后,我们利用TSE代谢监测系统,对雷公藤红素处理后大鼠摄食和能量代谢的改变进行检测,结合大鼠棕色和白色脂肪组织中氧化磷酸化通路基因表达情况,研究雷公藤红素负向调节能量平衡的作用和方式,明确雷公藤红素发挥肥胖治疗作用的具体机制。研究结果我们在急性毒性试验中发现,0~62.5 mg/kg b.w.剂量范围内,雷公藤红素对雄性ICR小鼠无致死急性毒性。依据不同物种间药物药效等效剂量换算表可知,大鼠的等效剂量约是小鼠的一半,则当雷公藤红素剂量小于30 mg/kg b.w.时,可安全用于大鼠模型。我们连续21天给予大鼠雷公藤红素处理,处理期内溶剂对照组大鼠体重基本保持稳定,摄食、精神、活动等一般状况均无异常;500μg/kg b.w.的雷公藤红素处理组大鼠体重逐渐下降,至21天时,体重平均减轻25.7 g,两组大鼠减重百分比存在统计学差异。组织H&E染色结果显示,两组大鼠白色脂肪组织形态正常,脂滴大小无明显差异;溶剂对照组大鼠肝脏存在较多脂滴,而处理组大鼠肝脏未见类似形态。两组大鼠葡萄糖、甘油三酯、血清总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平均未见显著差异。实验前后,两组大鼠口服葡萄糖耐量均表现为受损状态;雷公藤红素处理组大鼠胰岛素耐量有所改善,胰岛素敏感性略有提升。肠道菌群16s rRNA分析结果显示,两组大鼠肠道菌群β多样性存在较大差异,雷公藤红素处理组大鼠肠道菌群α多样性显著升高,拟杆菌门相对丰度增加,硬壁菌门相对丰度减少,差异存在统计学意义。并且,大鼠肠道菌群相对丰度随雷公藤红素处理时间发生改变,这种改变在处理两周后基本趋于稳定,拟杆菌门与硬壁菌门相对丰度呈现同步改变的趋势。抗生素干扰后,干扰组大鼠肠道菌群α多样性较单用雷公藤红素组有所下降,体重减轻速度明显减缓,至实验末期,两组大鼠减重百分比存在较大差异。下丘脑转录组测序结果显示,雷公藤红素处理组大鼠下丘脑共有153个基因表达上调,13个基因表达下调,G蛋白偶联受体信号通路、多巴胺受体信号通路、瘦素信号通路等均存在显著富集。由于瘦素是通过结合下丘脑内瘦素受体,激活下游POMC神经元和NPY/AgRP神经元,以抑制食欲并促进能量消耗,对调节机体能量代谢平衡具有非常重要的作用,因此我们重点关注瘦素信号通路的作用。雷公藤红素处理组大鼠血清瘦素水平在整个实验周期内呈现不断下降的趋势,但两组大鼠血清瘦素水平均未观察到显著差异。Stat3蛋白是瘦素的直接作用靶点,Stat3蛋白水平在两组大鼠中没有明显的差异,而磷酸化Stat3水平在雷公藤红素处理组显著升高,提示处理组大鼠瘦素信号通路处于激活状态。在杂合型瘦素敲除大鼠中,500μg/kg b.w.剂量雷公藤红素处理组大鼠体重并未减轻,1000μg/kg b.w.剂量组大鼠体重减重百分比与对照组存在统计学差异。而在纯合型瘦素敲除大鼠中,1000μg/kg b.w.剂量雷公藤红素处理未见减轻体重效应。能量代谢研究结果显示,雷公藤红素处理1周后,两组大鼠的呼吸交换率和活动水平均不具有统计学差异,而处理组大鼠白天和夜晚的能量消耗水平均显著高于对照组。处理组大鼠棕色脂肪组织脂肪酸代谢通路基因Adipoq、Fasn、Fabp4和Lpl表达上调,差异具有统计学意义,而白色脂肪组织未见上述改变。我们进一步比较了野生型和纯合型瘦素敲除大鼠在给予相同雷公藤红素处理时的能量代谢情况,发现纯合型瘦素敲除大鼠能量消耗水平显著低于野生型大鼠,而呼吸交换率和活动水平均未见差异。研究结论本研究发现:(1)雷公藤红素在小于62.5 mg/kg b.w.剂量下,未见致死急性毒性,以灌胃方式给药更为安全;(2)雷公藤红素在最低500μg/kg b.w.剂量时可减轻大鼠体重,提高胰岛素敏感性,增强能量消耗,但对于摄食行为和血脂相关生化水平没有影响;(3)雷公藤红素可改善肠道菌群多样性,提高拟杆菌门/硬壁菌门相对丰度比值,从而发挥减轻体重的作用;(4)瘦素信号通路参与了雷公藤红素增强能量消耗的过程,这种作用受到肠道菌群的严密调控。本研究初步评价了雷公藤红素的毒性,系统地阐述了雷公藤红素对大鼠肥胖的治疗作用及机制,为其潜在的临床应用前景提供了确切的科学依据和坚实的技术支撑。