论文部分内容阅读
对具有明确药理活性的中药活性单体进行必要的化学结构优化,继而开发各种可靠稳定的新型药物是中药化学领域的研究热点。硫代苦参碱衍生物M19（13-氨甲基-18-硫代苦参碱）是前期所开发的来自于传统中药苦参的高生物活性中药单体衍生物,前期研究已证明M19具有较好的体内外抗骨质疏松活性,但其也存在分子脂溶性较差、结构不稳定以及细胞毒性还有待改善等问题。此外,由于M19具有广泛的药理活性,易发生脱靶效应,难以直接作为抗骨质疏松药物应用。为了解决上述问题以提高M19的成药性并使其具有对骨质疏松症的精准治疗能力,本文围绕M19开展了传统化学结构修饰以及骨靶向多肽缀合物前药两种优化策略的探索。首先,本文对M19进行了芳香疏水基团引入的传统化学结构修饰策略。我们采用Discovery studio 2.5软件将基于靶点晶体结构所设计的一系列M19芳香化衍生物与其抗骨质疏松靶点核糖体蛋白S5（RPS5）进行了Lib Dock分子模拟对接,虚拟筛选出了综合打分最高且在化学手段上能够实现的目标化合物M54（13-二硫代氨甲基甲酸苄酯-18-硫代苦参碱）。随后我们以槐果碱为原料,经过硫代、迈克尔加成以及二硫代氨基甲酸酯化等反应顺利完成了M54的实验室合成,总收率8.8%,化学性质表征均经过ESI-MS,1H-NMR,13C-NMR确证。结构稳定性实验结果显示,M54水溶液在14天内未发现明显降解产物,较原型药物M19稳定性得到了大幅提高。体外生物活性表征实验结果显示,相比于原型化合物M19,其细胞毒性得到了降低并且其对破骨细胞分化成熟的抑制作用得到了提高。随后,我们通过慢病毒对RAW247.6细胞中的RPS5进行敲除,围绕M54的作用靶点和作用机制进行了验证并证实了我们虚拟筛选靶标选择的正确性。体内实验显示M54仍具有较好的抗骨质疏松活性,能够明显改善卵巢切除小鼠骨质的丢失并改善了骨密度（BMD）,骨体积分数（BV/TV）,骨小梁数（Tb.N）,单位体积骨表面积（BS/TV）等相关参数。最后,我们还针对M54实验室合成产率低下,合成步骤繁琐以及无法大规模生产等问题,对其合成工艺开展了研究。我们采用二氯甲烷代替原甲苯作为反应溶剂,解决了副产物难以处理导致产率低下的问题,并成功实现了一锅法制备M54-3,两步收率可达到40.4%。随后我们考察了精制方法并最终选用乙醇作为精制溶剂,成功解决了二氯甲烷的溶剂残留问题并且产物纯度达标。最后我们开展了放大合成,采用了百克级规模的原料投料,并能够成功获得百克级别的成品,纯度>98%,总收率28%。该部分工作表明,芳香化结构修饰成功改善了M19的化学结构稳定性,细胞毒性以及破骨细胞分化生长抑制活性,很大程度上提高了M19的成药性,使得最优衍生物M54具备了开发成为新型抗骨质疏松药物的潜力。更重要的是,我们首次报道了基于靶点RPS5晶体结构的苦参碱衍生物设计与虚拟筛选工作,该虚拟筛选结果与M54实际生物活性的提高相符,大幅提高了苦参碱衍生物开发研究的效率,对包括苦参碱在内的抗骨质疏松活性中药单体成药性提高研究都提供了较好的借鉴意义。此外,我们所开发的合成工艺简化了操作流程,提高了目标化合物的产率和纯度并且二氯甲烷溶剂残留达标,将原克级别的合成能力大幅提高到了百克级别,满足了后续研究对原料药的需求,使得最优衍生物M54具备了开发成为新型抗骨质疏松药物的基础条件,同时也为其他类似生物碱类中药活性单体的工艺开发研究提供了参考。其次,本文对M19开展了基于多肽-药物缀合物（PDCs）的前药修饰策略。我们将M19与具有骨靶向性质的多聚天冬氨酸通过组织蛋白酶K二肽底物亮氨酸-精氨酸相连接,设计得到了基于M19的骨靶向PDCs。随后我们通过固相多肽合成法（SPPS）与液相化学结合的方法成功合成系列目标缀合物,纯度>95%,总产率约在30%左右。结构稳定性实验结果显示,各多肽缀合物水溶液在14天内未发现明显降解产物,较原型药物M19稳定性得到了大幅提高。随后的生物活性表征实验结果显示,缀合物能够在组织蛋白酶K的作用下4小时内释放出95%以上的原型药物,80分钟内与羟基磷灰石产生95%以上的结合并且能够在糜蛋白酶的环境中保持结构的稳定,具备良好的药物释放效率、骨组织亲和性以及水解酶稳定性。此外,相较于原型药物M19,缀合物的细胞毒性效应得到了降低,并且除缀合物BTM19-1以外,缀合物对破骨细胞活性的抑制效果与原型药物相当。该部分研究结果表明,靶向前药修饰在稳定分子结构并赋予M19骨靶向性质的同时,还降低了原型药物的细胞毒性,保持了原型分子对破骨细胞的抑制活性,同样成功提高了M19的成药性。此外,该工作也是骨靶向PDCs应用于骨质疏松症治疗研究中的首次报道,我们所开发的该骨靶向PDCs构建策略适用性较广,为基于中药单体或其衍生物的其他类似骨靶向修饰工作提供了研究思路。