【摘 要】
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细胞核移植技术和转基因技术的发展为动物新品种的培育提供了新的技术平台。然而利用上述技术在转入目的基因的过程中,为了便于筛选,同时也转入了标记基因,抗生素抗性基因和
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细胞核移植技术和转基因技术的发展为动物新品种的培育提供了新的技术平台。然而利用上述技术在转入目的基因的过程中,为了便于筛选,同时也转入了标记基因,抗生素抗性基因和荧光标记基因是常用的标记基因。标记基因的应用引起了人们对其安全性方面的关注和担忧。而本研究的目的在于应用Cre/loxp重组系统,实现标记基因的安全删除。本研究首先给带有K14启动子的VEGF164基因两端带上两个相同方向的loxp位点,之后与pDsReD2-1载体连接,成功构建了表达载体pDsReD2-1-K14-VEGF-LOXP。之后用表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出纯度较高的转基因细胞克隆。获得的细胞克隆一部分用于生产转基因克隆绒山羊胚胎,经胚胎移植后获得了转基因的绒山羊,今后可以利用该转基因绒山羊的体细胞进行标记基因的删除研究。另一部分用带有信号肽片段的重组Cre酶即HTNC酶处理,用以检测不同的处理时间对转基因细胞标记基因删除效果的影响。收集不同处理时间的转基因细胞,并通过实时荧光定量PCR检测标记基因的去除效果,结果显示标记基因被部分去除,且最佳处理时间为3小时。本研究结果不但可以为今后核移植生产无标记基因的转基因绒山羊提供大量的供体细胞,同时对进一步获得符合生物安全要求的转基因绒山羊具有十分重要的意义。
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