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帕金森病(PD)是一种中老年人常见的神经系统变性疾病，病理特征主要表现为黑质多巴胺(DA)能神经元的丢失和路易小体(LB)的形成。临床上表现为肌强直、静止性震颤、运动迟缓及姿势步态异常等。PD的发病机制目前尚不完全清楚，许多证据显示，泛素—蛋白酶体系统(UPS)功能异常导致蛋白质异常聚集，是PD发病的共同病理生理学基础；用蛋白酶体抑制剂建立的细胞和动物模型更能体现PD的病理学特征，对于筛选和验证PD的治疗药物具有重要意义。自噬是异常蛋白质降解的另一条重要的途径，已知研究显示UPS功能障碍可以使自噬功能增强，但是在DA神经元内，关于这种自噬功能增强的机制以及病理生理学意义，目前尚不清楚。本研究探讨了UPS功能障碍诱导自噬功能增强的机制，以及对DA神经元存活的意义；胶质源性神经生长因子(GDNF)对于UPS功能障碍引起的DA神经元变性和包涵体形成的保护治疗效果及可能的作用机制。文章分为两个部分：
第一部分：UPS功能障碍诱导自噬功能变化机制及病理生理学意义的探讨。以蛋白酶体抑制剂lactacystin处理的腹侧中脑(VM)神经元和SH-SY5Y细胞为细胞模型。首先，利用Western印迹法、电镜、Realtime-PCR和免疫组化等方法检测UPS功能障碍对自噬以及p53 mRNA及蛋白表达水平的影响。其次，通过提前使用p53抑制剂pifithrin-α(PFT-α)及p53 RNA干扰(RNAi)等技术，抑制p53表达，观察对lactacystin诱导的自噬水平的影响；之后，利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或RNAi等技术抑制自噬相关基因Beclin1的表达，或者使用自噬增强剂雷帕霉素(RA)增强自噬，观察对p53及线粒体相关凋亡通路的影响；最后，利用RA预处理原代VM神经元，进一步激活自噬，观察能否对UPS功能障碍引起的DA神经元变性起到神经保护作用。研究结果发现，UPS功能障碍可以增强DA神经元内自噬水平，增高p53表达水平；而抑制p53表达，则减弱UPS功能障碍介导的自噬功能增强，增加α-共核蛋白聚集水平。提前抑制自噬功能，可以部分阻断UPS功能障碍诱导激活的p53及线粒体相关凋亡通路；而提前增强自噬，具有相反的作用。RA预处理部分改善UPS功能障碍产生的神经元毒性作用，对DA神经元起到保护作用，这种保护作用与增强α-共核蛋白降解有关。这部分研究结果表明，p53部分地介导了UPS功能障碍诱导的自噬功能增强，这种增强的自噬，反过来，部分抑制p53及线粒体相关凋亡通路，在一定程度上，有利于DA神经元的存活；利用RA进一步增强自噬，可以保护UPS功能障碍的VM神经元模型，其保护机制与增强异常蛋白隆解，抑制p53和下游线粒体相关凋亡通路有关，提示RA在PD发病中具有潜在的保护治疗作用。
第二部分：GDNF对UPS功能障碍小鼠模型治疗作用的研究。采用单侧内侧前脑束(MFB)立体定位注射lactacystin，建立UPS功能障碍的C57BL小鼠模型，注射后1w，部分小鼠通过纹状体微泵注射，给予GDNF0.48μg/d，持续2w，之后收集标本行相关检测。首先，通过Western印迹法、高效液相色谱分析等方法检测GDNF的保护治疗效果：其次，分析GDNF的保护治疗作用与影响丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)及AKT通路的相关性。研究结果显示，lactacystin注射后3w可以明显损伤DA神经元，减少纹状体DA及其代谢产物的水平，而微泵持续注射GDNF2w，可以增加31％黑质DA神经元数目，以及40％的纹状体DA水平。Lactacystin诱导DA神经元变性与促进c-Jun氨基端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)磷酸化有关。GDNF的保护作用与进一步增强ERK和Akt磷酸化，同时降低p38和JNK磷酸化水平有关。这部分研究结果表明，微泵持续注射GDNF对UPS功能障碍小鼠具有保护作用，其保护机制与调节p38，JNK，Akt及ERK等信号通路的磷酸化水平有关。