腺苷酸环化酶Ⅲ(AC3)在非神经细胞中定位的研究

• 作 者: 郝江叶
• 机 构: 河北大学
• 出 处: 河北大学
• 发表日期: 2014年期
• 关键词: 酶腺苷酸环化酶Ⅲ 初级纤毛 RT-PCR 免疫荧光 定位

cAMP作为细胞内最重要的第二信使之一，调节细胞的许多生物学功能，包括卵子发生、胚胎发育、幼体发育、荷尔蒙分泌、糖代谢、平滑肌收缩、心脏收缩、嗅觉、学习以及记忆等。腺苷酸环化酶(AC)是cAMP信号转导通路的重要组分，其主要作用是催化ATP生成cAMP。AC3是AC家族中的第3个成员，它是已分离、鉴定的其中9个膜整合蛋白之一。研究发现AC3不仅表达于小鼠海马区、下丘脑和嗅觉表皮组织等部位的神经细胞纤毛，还广泛存在于脊髓、肾上腺髓质和皮质、心房肌、主动脉平滑肌、肺、肾、胰岛、睾丸和卵巢等多种组织器官，并与多种生理功能密切相关。纤毛是突出于真核细胞表面的、以微管为结构基础的“毛发状”细胞器，它能感知细胞外机械和化学信号刺激。纤毛分为两大类：运动纤毛和不动纤毛，不动纤毛即初级纤毛，它普遍存在于多种生物的各种类型细胞表面。初级纤毛上含有多种特异受体、离子通道蛋白和信号转导蛋白等。近年发现初级纤毛参与了细胞内信号传导等多种细胞生物学过程，对动物的发育调控及维持各个组织器官正常生理功能具有重要作用。尽管AC3表达在多种非神经细胞中并具有重要的生理功能，但它在这些非神经细胞的表达部位，尚待确定。本研究旨在明确AC3在这些非神经细胞中的表达情况以及表达部位。本论文以大鼠嗜铬细胞瘤PC12、人神经胶质瘤细胞U251、小鼠肾内髓集合管上皮细胞IMCD3、人肾上皮细胞293T、骨髓基质干细胞BMSCs、成骨细胞OB、人宫颈癌细胞HeLa和人肺癌细胞A549为研究材料。研究的内容主要分为2个部分：第一部分通过RT-PCR技术对细胞的AC3基因mRNA表达水平进行半定量，PCR产物DNA测序，所得序列用生物学软件DNAMAN6．0分别将人和鼠的AC3基因cDNA进行比对分析。第二部分：运用细胞免疫荧光染色，对PC12、U251、IMCD3、293T、OB和BMSC以及A549和HeLa细胞中AC3的表达部位进行确定。研究结果如下：1、以AC3基因的特异性引物，扩增并检测AC3基因在相关细胞中有扩增产物，对PCR产物测序并进行比对分析显示，这些细胞中均有AC3基因的内源性表达。2、免疫荧光染色结果显示PC12和U251细胞株中均发现了阳性标记的AC3抗体，并与纤毛标记抗体Acetylated α-Tubulin染色发生重叠。小鼠IMCD3细胞株和人肾组织的293T细胞中大多细胞具有初级纤毛亚结构，且AC3亚定位于该细胞的纤毛部位，在这两种肾细胞中， AC3表达于初级纤毛。BMSC细胞中能直观地观察到AC3亚定位于初级纤毛上。在A549细胞中AC3阳性结果与初级纤毛标记物Acetylated α-Tubulin阳性结果完全重合，且AC3沿着初级纤毛轴丝分布；在HeLa细胞中初级纤毛与AC3的分布情况类似于A549细胞中的结果。虽然OB细胞中也有阳性AC3呈颗粒状红色荧光，但AC3与初级纤毛并不存在共定位关系。结论：1、AC3基因内源性表达于PC12、U251、IMCD3、293T、BMSCs、OB、HeLa和A549细胞。2、AC3表达于神经细胞初级纤毛，并可以作为神经细胞初级纤毛的标志物。3、除OB细胞外，AC3也定位在检测的5种非神经细胞纤毛中。