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拿捕净(Sethoxydim)是80年代初筛选出的一种高活性的除草剂,它属于环己烯酮类,这类除草剂作用的靶蛋白是乙酰辅酶A羧化酶(ACCase).环己烯酮类除草剂被专门用来防治禾本科杂草,对双子叶作物高度安全,但不能用于禾本科作物.由于这些除草剂具有用量少、活性高、在土壤中易分解等优点,近年来在生产中得到了广泛应用.该研究从高抗拿捕净的谷子品系和普通谷子中克隆出了ACCase基因,并对它们的序列进行了比较,找出了拿捕净作用的靶位点序列.在此基础上,将抗性谷子中克隆的ACCase基因转入玉米自交系中,获得抗拿捕净的转基因植株.同时采用组织培养的方法筛选玉米抗性突变体,获得了有价值的抗性材料,并对其抗性机制进行了探讨.在体细胞无性系突变体的筛选方面,我们直接在培养基中加入一定浓度梯度的拿捕净,通过多轮筛选,最后存活的愈伤组织被认为是抗性愈伤组织.对抗性愈伤组织进行诱导,最终分化成苗.该实验共采用了两个处理:处理一(采用0.5、1、2、5、10 μ M的拿捕净浓度梯度)最终获得了31棵再生植株;处理二(采用5、10、20、50μ M的浓度梯度筛选)仅有综31获得了一个抗性愈伤组织,但无法分化成苗,该愈伤组织在200 μ M的拿捕净浓度下依然能维持旺盛生长.克隆了这个抗性愈伤组织的质体ACCase基因,序列比对发现,它编码的氨基酸并没有发生改变.Southern blotting结果表明,它与对照的杂交信号并没有明显的变化,但杂交条带的大小发生了变化.Northern blotting结果表明,杂交信号比对照增加了2.5倍.根据禾本科作物质体ACCase cDNA序列的保守性,直接采用RACE技术从高抗拿捕净的谷子品系和野生型谷子中克隆出ACCase基因,采用生物信息学的方法证明所克隆的基因编码质体ACCase而非胞质溶胶ACCase.将它们的氨基酸序列与其它物种的真核型ACCase相比较,发现抗拿捕净谷子质体ACCase氨基酸序列的1780处为异亮氨酸,而野生型谷子的为亮氨酸,从而验证了质体ACCase CT功能域的这个单一的氨基酸残基是拿捕净作用的靶位点,它的突变造成了谷子对拿捕净抗性的改变.Southern blotting结果表明,质体ACCase基因在谷子中只有一个拷贝.将克隆的谷子抗拿捕净质体ACCase全长cDNA构建到植物表达载体中.首先对植物表达载体pCAMBIA3301进行了改造,去除了筛选标记基因,将35S启动子换上了在禾本科植物细胞中高效表达的启动子UBI,去除了GUS基因,最后将抗拿捕净谷子质体ACCase全长cDNA构建到其上.采用根癌农杆菌介导法将其转入到玉米的三个优良自交系178、Z3和Z31的幼胚和愈伤组织中.经过共培养、恢复培养、抗性筛选、诱导胚状体以及分化等步骤,最终获得了89棵再生植株.对再生植株进行了PCR和Southern blotting等分子检测,绝大多数再生植株表现为阳性.对部分T1代转基因植株进行了拿捕净抗性检测.结果表明,部分转基因玉米植株表现出对拿捕净的抗性.