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胆红素是哺乳动物体内血红素代谢的最终产物。高胆红素血症是由胆红素产生增加或排泄减少所致，主要临床症状是黄疸，新生儿高胆红素血症发病率很高，尤其是早产儿，严重者可发生胆红素脑病。胆红素脑病指新生儿出生一周内，血清中胆红素的浓度升高所致的急性脑损伤，又称核黄疸，其死亡率也很高，即使幸存，也会造成严重的后遗症。对于其致病机制的研究，主要包括细胞质膜、线粒体膜、内质网膜的损伤，细胞内钙离子的失衡，细胞的能量代谢障碍，神经细胞的兴奋性毒性作用以及细胞凋亡。但具体的发病机制未明，临床上也无特效的治疗措施，故胆红素介导的神经系统损害仍是研究的热点。 在本研究中，通过腹腔注射胆红素，复制新生SD大鼠高胆红素血症及胆红素脑病，并进行鉴定和评价；同时在神经瘤母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞上，研究胆红素致神经细胞损害的可能发病机制。 第一部分 新生大鼠高胆红素血症及脑病模型的建立与评价 目的：胆红素脑病是临床新生儿常见的疾病，死亡率高，仍是目前研究的热点。但尚无适合研究的稳定高胆红素血症模型。在本实验中，以3d龄SD新生大鼠为研究对象，利用新生鼠血脑屏障不完善的特点，腹腔注射胆红素，制作一种既不改变基因型，又不改变体内正常物质代谢的高胆红素血症新生大鼠，并对其相关指标进行测定和评价，以期为该领域的研究建立和确定稳定的高胆红素血症动物模型。 方法：将3d龄SD新生大鼠按窝系和体重随机均分为7组，分别经腹腔注射生理盐水（Con），胆红素6.25μg/g（T1），12.5μg/g（T2），25μg/g（T3），50μg/g（T4），100μg/g（T5），200μg/g（T6），2次/d，共3d。末次注射12h后拍照、称体重、取材，称量胃内容物重量，计算胃指数和肝/体比，测定血清总胆红素和游离胆红素浓度，检测脑组织的含水量、胆红素、ATP含量，进行HE和尼氏染色。 结果：随着注射次数和剂量的增加，新生鼠出现下述变化：（1）一般表现逐渐变差，皮肤和粘膜黄染加重，活动次数逐渐减少；（2）体重增长被抑制，T6组出现体重负性增长；（3）死亡率逐渐升高，T6组72h后死亡率接近100%。与Con组相比，T3和T4组胃内容物重量和胃指数有显著性差异（p＜0.05），T5组有非常显著性差异（p＜0.01）；（4）新生鼠肝脏出现肿胀，T5组肝/体比显著性升高，与Con、T1组相比差异有显著性（p＜0.05）；（5）血清总胆红素、游离胆红素和脑组织总胆红素的浓度逐渐递增；（6）各组大鼠脑组织的含水量没有差异（p＞0.05）；（7）脑组织ATP含量先升高，在T3组达到最高峰后降低，T5组与Con组相比，差异有显著性（p＜0.05）；（8）HE染色结果显示：随着胆红素浓度升高，各组大鼠大脑皮层神经元数量逐渐减少，T4和T5组，神经元结构紊乱，细胞肿胀，核固缩，有碎裂、溶解等变化；（9）尼氏染色显示：随着胆红素浓度的增加，新生鼠皮质神经元变小，尼氏小体减少，颜色逐渐变浅，T5组新生鼠脑皮质神经元部分溶解甚至消失。 结论：新生3d龄SD大鼠腹腔注射胆红素12.5、25、50和100μg/g，2次/d，注射3天可致高胆红素血症，50和100μg/g可引起胆红素脑病的发生，鉴于模型的稳定和后续死亡率的变化，50μg/g更适应于高胆红素血症及胆红素脑病模型的复制。 第二部分 胆红素致神经细胞损伤及其机制的研究 目的：胆红素致神经细胞元损伤的机制涉及很多方面，包括自由基的损伤，能量代谢的障碍，近来认为胆红素导致神经元损伤主要与细胞凋亡有关。本研究中，在高胆红素血症新生鼠和人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞上，来探讨胆红素致神经细胞损伤的可能发病机制。 方法：新生大鼠腹腔注射胆红素和用胆红素处理SY5Y细胞，通过普通光镜进行观察、拍照和筛选，CCK-8检测细胞生存活性，荧光显微镜检测细胞形态学，流式细胞仪进行凋亡细胞计数，PI染色测定细胞的凋亡坏死，以及Western blot检测凋亡相关蛋白的变化。 结果：1．新生大鼠经过3d胆红素腹腔注射后，经过Western-blotting检测凋亡相关蛋白，发现Ba x显色加深，且caspa se-9染色变浅，caspase-3出现切割条带，表明大鼠出现高胆红素血症血症后，神经元出现凋亡，且可能是通过线粒体途径实现的。因为caspase-8无明显变化，说明凋亡与死亡受体途径无关。同时，检测泛素化的蛋白和蛋白酶体底物Ikb-α、p27分子，发现经过随着胆红素注射剂量的增加，泛素化的蛋白质增多，蛋白酶体的底物分子也增加，表明胆红素能抑制了泛素-蛋白酶体的功能。 2.在1%的血清培养条件下，胆红素分别处理SY5Y细胞12h、24h后，细胞均发生了形态变化，随着胆红素浓度的升高，细胞死亡增加；而在血清为10%培养条件下，胆红素对神经瘤细胞无毒性。 3.胆红素作用SY5Y细胞12h和24h后，cck-8测定细胞活力。结果显示，血清浓度为1%时，，随着胆红素的浓度增高，细胞活力逐渐降低。在10%血清培养条件下，胆红素对细胞活力无影响，各组细胞的生存活性无统计学差异。 4．胆红素作用于SY5Y细胞后，用流式细胞术检测细胞的死亡率。结果显示：用1%血清的条件培养基，胆红素对细胞的毒性作用随着浓度的增加而升高，细胞死亡增多；在10%血清的条件下培养细胞，胆红素对神经瘤细胞无明显毒性，各组瘤细胞的死亡率无显著性差异。 5．在血清浓度为1%的条件下，胆红素处理SY5Y细胞12h，用PI染色观察细胞凋亡坏死情况。结果显示：在血清为1%条件下，随着胆红素浓度的增加，PI阳性显色的细胞逐渐增多，证明胆红素对神经细胞损伤机制之一是导致细胞凋亡坏死。 6．为了进一步证明胆红素致神经瘤细胞的损伤是通过凋亡实现的，采用Western blot测定细胞凋亡的相关蛋白。结果显示，在1%血清的培养条件下，不同浓度的胆红素处理细胞12h，随着胆红素浓度的升高，细胞内凋亡相关的蛋白分子Ba x染色加深，并且PARP出现切割条带，说明细胞发生凋亡；又根据前面的结果，选择特定的胆红素浓度25μM，培养不同的时间，发现随着时间的延长，Ba x染色加深并伴有典型的PARP的切割条带，进一步证明胆红素诱导神经瘤细胞凋亡，同时，发现随着胆红素浓度的升高，泛素化的蛋白质增多，进一步证实胆红素抑制了泛素-蛋白酶体的功能。这可能是胆红素的神经毒性之一。 结论：胆红素对神经细胞的毒性作用跟血清蛋白质的含量有关。同时，胆红素致神经元的损伤是由于激活了细胞凋亡途径，且该途径是因为胆红素抑制了泛素-蛋白酶体的功能而介导的。