论文部分内容阅读
脱落酸(ABA)作为一种调控生长发育的激素，对植物多种生理过程起着调控作用。近年，ABA在植物适应逆境胁迫中的作用倍受关注。研究ABA合成途径中的关键酶，通过基因工程调控内源ABA的生物合成，成为提高植物抗逆性的一个重要途径。生物化学和遗传学的证据表明9一顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoiddioxygenase，NCED)催化的氧化裂解反应是高等植物ABA合成途径中的关键步骤。前人的研究证明NCED基因受逆境胁迫的诱导，其表达产物调控逆境条件下ABA的合成。NCED在转基因植物中的过量表达提高了内源ABA的水平并提高了耐旱性。柱花草(Stylosanthesguianensis)是一种在热带和亚热带地区广泛种植的耐旱牧草，柱花草中的NCED基因未被克隆和研究。本文从柱花草叶片中克隆了一个编码NCED的基因，命名为SgNCEDl。以SgNCEDl基因的主体片段为探针进行Northern杂交，分析了几种逆境胁迫下柱花草ABA含量与SgNCEDl基因表达的关系。构建了SgNCEDl基因的表达载体，转化烟草，研究SgNCEDl基因在提高烟草抗逆性特别是抗氧化胁迫中的作用，为利用SgNCEDl基因进行草类植物的抗逆基因工程改良打下基础。
1、柱花草SgNCEDl基因的克隆
根据已报道的三种豆科植物的NCED基因同源序列设计简并引物，用RT-PCR结合RACE以及嵌套PCR的方法，从水分胁迫的柱花草叶片中克隆了SgNCEDl基因，其cDNA全长由2241bp组成，其开放阅读框架为1809bp，编码602个氨基酸。Southem杂交结果表明该基因在柱花草基因组中以单拷贝形式存在。氨基酸序列同源比对和系统进化分析表明SgNCEDl与花生的AhNCEDl高度同源(92％)，与另外三种豆科植物的NCED也有很高的同源性(72％一75％)，与其他科已报道的NCED蛋白序列同源性在68％以上。亚细胞定位预测表明SgNCEDl蛋白的N一末端具有叶绿体转运肽。
2、几种逆境诱导的SgNCEDl基因表达分析及ABA含量变化
Northem杂交的结果表明，SgNCEDl基因在柱花草叶片和根部均有表达，在干旱胁迫下的ABA合成调控中起重要作用。SgNCEDl基因在短时间内就能强烈响应脱水和盐胁迫的诱导，低温胁迫也能诱导SgNCEDl的表达。干旱、脱水、低温和盐胁迫下，柱花草的内源ABA均大量积累，ABA的合成与SgNCEDl基因的表达基本同步。SgⅣCEDl基因编码的蛋白是柱花草ABA合成途径中的关键酶，调控逆境胁迫下ABA的合成。
3、SgNCEDl基因转化烟草及功能分析
构建了SgNCEDl基因的表达载体pBI—SgNCEDl，并用农杆菌介导的方法转化烟草(Nicotianatabacum)。Southem和Northern杂交以及RT-PCR的结果表明，SgNCEDl基因插入了植株编号为5、S6、S8、S16、S24和P54的烟草基因组中，并且得到了表达。对转基因烟草的分析证明，SgNCEDl基因的表达提高了烟草内源ABA的含量，为野生型的1．7到3．52倍，提高了转基因烟草的抗旱和耐盐性，在一定程度上降低了气孔导度和蒸腾速率，但光合速率维持在正常水平，转基因烟草的生长并未受到明显抑制。
4、转SgNCEDl基因烟草的抗强光和抗氧化胁迫分析
SgNCEDl基因的过量表达提高了转基因烟草对强光和氧化胁迫的抗性。强光处理下，野生型对照植株的Fv／Fm、①PSII和NPQ降低，而转基因烟草的Fv／Fm、ti>PSII和NPQ维持在较高水平；百草枯处理下，野生型对照植株的Fv／Fm、φPSII、qP和NPQ降低，而转基因烟草的Fv／Fm、f1)psII、qP和NPQ维持在较高水平，表明转基因烟草具有较强的热耗散能力，能够减缓强光和氧化胁迫对光合机构的伤害，维持较高的光合效率。转基因烟草能够维持膜的稳定性，减缓PQ处理下氧化胁迫对质膜的伤害，但是转基因烟草的SOD和CAT活性在非胁迫条件下和O.1mMPQ处理3h的情况下均无明显提高，内源ABA的提高可能通过其他途径提高了烟草的抗氧化胁迫能力。