靶向毁损触液核对切口痛大鼠不同时间点痛行为及脑脊液ENK含量的影响

来源 :徐州医学院 徐州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:whsdht
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目的:通过创新应用霍乱毒素亚单位B一皂草素交联复合物(CB-SAP)靶向毁损触液核神经元技术、特异性地毁损触液核,建立缺失触液核的动物模型,考察触液核对切口痛大鼠行为及其脑脊液中ENK含量的影响,为触液核经脑一脑脊液环路及ENK参与痛觉调制提供形态与物质依据。  方法:1.缺失触液核动物模型的建立雄性SD大鼠(250±50g),随机分为CB-SAP组:(侧脑室注射靶向毁损剂CB-SAP,500ng/3ul); CB组:(侧脑室注射毁损剂耦合载体,也是触液核神经元特异性标记物CB,500ng/3ul); CB-SAP组又分为毁损1、3、5、7、10天等5个亚组。CB组于注射后1天处死大鼠,CB-SAP组分别于注射后1、3、5、7、10天处死大鼠,取触液核所在段脑组织,冰冻切片,应用免疫荧光化学标记技术与激光共聚焦显微镜技术相结合,观察术后触液核内CB阳性神经元,即触液核神经元残留情况。Image-Pro Plus6.0图像软件比较各时间点的毁损率,以确认触液核被完全毁损的时间点,建立缺失触液核的动物模型。  2.缺失触液核切口痛大鼠痛行为的检测雄性SD大鼠,随机分为CB-SAP组和PBS组。CB-SAP组按1相同方法侧脑室注射靶向毁损剂CB-SAP;PBS组用PBS(CB-SAP的溶媒)代替CB-SAP侧脑室注射。参照1的实验结果,以触液核被完全毁损的时间点作为大鼠痛行为的观测起点。于此时间点,按Brennan法[1]进一步施加切口痛刺激,检测两组大鼠切口痛术前及术后4、8、16、24小时的机械缩足阈值(Mechanical withdraw threshold,MWT)。  3.缺失触液核切口痛大鼠脑脊液中ENK检测雄性SD大鼠,随机分为CB-SAP组和PBS组,每组又分为术前及术后4、8、16、24小时等五个亚组。CB-SAP组和PBS组的处理同方法2,抽取两组大鼠切口痛术前及术后4、8、16、24小时的脑脊液,用ELISA法检测脑脊液中ENK的含量。  结果:1.缺失触液核动物模型的确立  CB组:触液核CB阳性神经元恒定出现在脑干的特定节段,高度集中,计数恒定:277±14。CB-SAP组:侧脑室引入CB-SAP后第1天,大部分触液核CB阳性神经元轮廓基本清晰,但少量CB阳性神经元胞体和胞核体积缩小,触液核CB阳性神经元计数为242±11,与CB组相比,约88%的CB阳性神经元残留,差异统计学意义(P<0.05);随着天数的增加,触液核CB阳性神经元缺失量越来越多;第7天未观测到完整的CB阳性神经元,全部的触液核CB阳性神经元缺失,差异有统计学意义(P<0.01);第10天,仍未观测到CB阳性神经元。  术前:CB-SAP组大鼠的MWT/TWL基础值为14.22±3.83g/10.33±0.79s,低于PBS组的21.31±3.23g/15.35±0.75s(P<0.01)。  术后:CB-SAP组术后4、8、16、24小时的MWT/TWL值(4.12±1.26g/3.71±0.82s,5.37±1.48g/4.18±0.59s,6.77±1.41g/5.77±0.72s,6.77±1.64g/6.19±0.74s)均低于PBS组(7.63±1.40g/5.17±1.01s,9.95±1.83/9.36±1.34s,10.30±2.19g/10.10±1.21s,11.30±1.76g/11.05±0.88s),差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。PBS组的MWT/TWL值在术后4小时降至最低值,然后逐渐恢复,与术后4小时相比,术后8、16、24小时的的MWT/TWL值,均出现显著增高,差异有统计学意义(P<0.01); CB-SAP组的MWT/TWL值在术后4小时降至最低值,但与术后4小时相比,术后8小时的MWT/TW值未出现显著性升高(P>0.05),至术后16、24小时才出现显著性增高(P<0.05或0.01)。  3.缺失触液核切口痛大鼠脑脊液EN含量的改变  术前CB-SAP组的ENK含量的基础值为218.54±15.57 pg/ml,低于PBS组的256.99±16.16pg/ml(P<0.01)。术后PBS组和CB-SAP组大鼠脑脊液中ENK的含量都在术后4小时达到峰值,术后24小时达最低。术后4、8、16、24小时,CB-SAP组的ENK含量为分别为253.58±23.08pg/ml,242.55±19.73pg/ml,189.61±16.16pg/ml,108.22±10.65pg/ml低于CB组的291.53±24.70 pg/ml,273.51±21.82 pg/ml,210.82±16.89 pg/ml,149.18±10.3 pg/ml差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。  结论:1.侧脑室引入CB-SAP后,随着时间的推移触液核毁损程度逐渐增高,至第7天触液核被完全毁损,此时间点为缺失触液核动物模型建立成功的时间点。2.触液核缺失大鼠的MWT/TWL在术前及切口痛术后均显著性降低,提示触液核在生理状态下及急性术后痛过程中均参与了痛觉调制,且主要发挥痛觉抑制作用。3.触液核缺失大鼠脑脊液中ENK含量在术前及切口术后均显著性降低,提示触液可提高脑脊液中ENK的含量,并可能介由ENK通过脑(神经)—脑脊液(体液)途径参与了急性术后痛的调节。
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