药用牛肺表面活性物质组成分析及质控方法的研究

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牛肺表面活性物质(Bovine Pulmonary Surfactant,BPS)是牛的肺泡Ⅱ型细胞分泌的由脂质和疏水性蛋白质组成的复合物。新生儿缺乏肺表面活性物质会导致呼吸窘迫综合症的产生。应用牛肺表面活性物质替代治疗是经典方法。药用牛肺表面活性物质还可治疗胎粪吸入综合征、新生儿重症肺炎、肺出血和支气管肺发育不良等。  由于药物组分性质特殊,对于强疏水性蛋白和磷脂组的定性和定量分析是难点。一是磷脂分子间结构性质相似,分离困难;二是磷脂与疏水性蛋白间存在相互作用,会相互干扰,影响检测结果的准确性;三是蛋白SP-C存在多种剪切体。传统的单个蛋白分析方法不足以实现准确分析的目的。对于其中的磷脂组分,传统的分析手段如薄层色谱、高效液相色谱不能对磷脂组的全面、准确分析,脂质组学技术可以解决这一问题。  要建立一套适用于药用牛肺表面活性物质中蛋白和磷脂的分析方法,实现蛋白和磷脂组的定性和定量;并将其应用于不同来源的药用牛肺表面活性物质的分析。  1、建立了基于分子排阻色谱法除去药用牛肺表面活性物质中脂质的方法。  2、建立了MALDI-TOF-MS和LC-Q-TOF-MS测定蛋白指纹谱的方法,测得蛋白SP-B以二聚体形式存在,其二聚体分子量是17398.63Da,SP-B单体分子量是8704.55Da,与理论分子量一致。  3、建立了液相色谱高分辨串联质谱LC-MS/MS(QE)鉴定蛋白SP-C剪切体和棕榈酰化修饰的方法,鉴定到47条蛋白SP-C不同剪切体或者修饰。  4、建立了准确定量药用牛肺表面活性物质中蛋白的ELISA法,测得药用牛肺表面活性物质中总蛋白的含量约1%。  5、建立了基于“鸟枪法”脂质组学技术的磷脂相对定量方法。测得药用牛肺表面活性物质中PC最多,其次是PG、PI和PS,再次是LPE和LPS,最少的是PA、LPC和PE。
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