全人源抗破伤风毒素单克隆抗体筛选与功能研究

• 作 者: 林淑健
• 出 处: 暨南大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 破伤风毒素C片段 破伤风毒素 破伤风类毒素 中和抗体 全人源抗体 治疗

破伤风是由破伤风梭状芽胞杆菌分泌的一种神经毒素引起的严重疾病,主要临床症状为牙关紧闭,局部或全身肌肉呈阵发性或强直痉挛,因此又称强直症。灭活毒素(类毒素)制成的破伤风疫苗能有效的预防破伤风,但破伤风仍然在低收入和中等收入国家中流行。破伤风导致死亡和致残主要发生在未接种疫苗人群中,尤其在孕妇和新生儿中死亡率极高。破伤风疫苗免疫不是终身的,建议每十年进行一次加强免疫,但是许多国家对加强免疫方面意识薄弱。因此,破伤风主要发生在伤口被泥土、粪便、土壤或唾液等污染而没有足够破伤风免疫力的个体中。破伤风的被动免疫主要依赖马破伤风抗毒素和人免疫球蛋白。马破伤风抗毒素因存在血清疾病和过敏的风险早已被工业国家所淘汰,也没有被世卫组织的列入基本药物清单。人免疫球蛋白虽然在有效性和安全性方面优于马破伤风抗毒素,但具有传播已知和未知传染性病原的潜在风险。在中国,因破伤风人免疫球蛋白对原料要求高且供应较少,经常是一药难求。因此,迫切需要一种高效、安全的抗破伤风单克隆抗体(mAb)来取代马和人血清来源的免疫球蛋白,以满足破伤风感染预防和治疗的需要。破伤风毒素由二硫键连接的50 kD氨基末端轻(L)链和100 kD羧基末端重链(H)链组成。根据其在体内的功能分为A、B、C三个片段。A片段是毒素的活性部分,具有金属蛋白酶活性。B片段是N末端易位结构域,负责毒素转运。C片段包含受体结合结构域,没有神经毒性。目前认为A片段和C片段是中和毒素的潜在靶标,用于开发中和性抗体。因此,我们利用完整毒素筛选抗破伤风抗体,探索毒素不同区域作为靶点在中和作用中的贡献。本论文重点研究靶向破伤风毒素C片段抗体的中和机制,揭示破伤风毒素C片段的中和靶点,为破伤风新疫苗的设计奠定基础。本研究通过天然全人源单克隆抗体研究开发平台,从一名免疫志愿者体内分离到32株具有破伤风类毒素结合活性的单克隆抗体,其中5株特异性针对破伤风毒素C片段(TTC)。5株抗体与破伤风毒素均具有高的亲和力且可能针对3个不同的表位。在20LD50毒素剂量下的小鼠保护试验中,TT0067具有较高保护性中和效价,其完全保护小鼠免受死亡的剂量范围为50μg/mL-5.56μg/mL。TT0067抗体效价相当于约3 mg等同于一瓶250 IU的商业化人免疫球蛋白。对TT0067与TTC蛋白X射线共晶体结构进行分析探究单抗TT0067中和破伤风毒素的作用机理,结果显示TT0067能完全中和毒素是由于其直接占据受体结合位点之一的W口袋,阻断了TTC与靶细胞表面神经节苷脂的结合。本研究证实TTC作为中和抗原表位,开发TTC作为诱导保护性中和抗体的疫苗是可行的。同时基于共结晶结构和氨基酸单点突变鉴定结合关键氨基酸,进一步证实了位点W1289、H1293、D1296对于TT0067与TTC的结合至关重要。综上所述,我们筛选出一株能够很好地中和破伤风毒素的天然全人源单克隆抗体TT0067,其具有极高的发展潜力作为治疗性抗体用于破伤风感染的预防和治疗。同时,在原子水平揭示了TT0067与破伤风毒素C片段的关键中和表位,为开发更好、更安全的破伤风疫苗提供了关键信息。