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棉花黄萎病是世界上棉花作物的难治性病害。棉花黄萎菌病毒VdCV1本实验室已经报道,但对该病毒功能及其基因功能尚未做实验研究。研究建立快速高效的黄萎菌遗传转化方法,进而建立真菌病毒ATMT法的侵染性克隆体系,对研究棉花、棉花黄萎菌以及棉花黄萎菌病毒三者之间的互作关系,以及对真菌病毒及其基因功能研究具有重要意义。本文为此作前期研究和探索。
本研究首先以植物表达载体PH7WG2D为基本骨架,通过重叠PCR技术将病毒VdCV1的OUT基因序列。VcR4进行改造,获得含35S+VcR4+Ribozyme+Nos序列的attBPCR产物,通过Gateway技术的BP反应构建入门载体,入门载体与双元表达载体pH7WG2D通过LR反应构建双元表达载体PHVcR4,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序分析表明载体构建成功。然后,以植物表达载体PK7WG2D为基本骨架,通过同样的方法改造潮霉素基因,使其含有trpC启动子和Nos终止子,成功构建了双元表达载体PKHyg。
利用低浓度放线菌酮处理结合菌丝尖端分离脱毒和光照培养的方法处理棉花黄萎菌0-21,经过RT-PCR验证得到脱病毒菌株0-21。以构建的载体PHVcR4、PKHyg转化农杆菌菌株GV3101,以及所购用于真菌农杆菌介导转化(ATMT)的载体pBHt1农杆菌C58C1,采用ATMT法转化棉花黄萎菌。结果显示,PHVcR4质粒农杆菌转化黄萎菌获得了具有绿色荧光的孢子和菌丝,但未能获得具有抗性的转化子,原因可能是表达质粒中的目的片段未能整合到棉花黄萎菌基因组中,绿色荧光属于GFP瞬时表达,或者可能是表达质粒中的目的片段整合进了棉花黄萎菌基因组,但启动子未启动潮霉素基因转录。PKHyg质粒农杆菌转化黄萎菌时在荧光倒置显微镜下未见到绿色荧光,抗生素筛选也未能获得转化子,可能与载体PK7WG2D不适合作为真菌转化载体有关。pBHt1质粒农杆菌转化黄萎菌未能筛选到具有抗性的转化子,可能与农杆菌菌株为C58C1有关。黄萎菌的转化有待进一步分析验证和改进。
采用瞬时表达法,利用构建的OUT基因重组载体PHVcR4以及对照载体pHCm,初步探讨了OUT基因对转GFP基因本氏烟16C的基因沉默系统的抑制作用,研究发现OUT基因不是植物的沉默抑制子,同时发现带有GFP基因的Gateway双元表达载体可用于基因沉默抑制研究。