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背景:肝功能衰竭是由病毒、药物、酒精等多种因素所致的一种临床综合征,主要表现为肝脏合成、解毒、排泄和生物转化功能等发生严重障碍或失代偿,临床特征为凝血功能障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等,病情重、发展快、病死率高。流行病学调查显示,我国肝衰竭的主要病因为HBV感染,临床上主要表现为慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure,ACLF),且其发病率呈增加趋势。肝衰竭的发病机制尚未完全阐明,是目前临床与基础研究的热点。近年来NLRP3炎性小体在各种肝脏疾病中的作用受到了越来越多的关注,其结构包括NOD样受体NLRP3,衔接分子ASC及效应分子pro-Caspase-1。当NLRP3炎症小体与衔接分子ASC形成复合物时,pro-Caspase-1被激活为成熟的Caspase-1,并最终导致IL-18及IL-1β的活化与释放。目前已有研究证实,NLRP3炎症小体的激活在对乙酰氨基酚所致急性肝损伤中发挥了免疫调节作用,但关于NLRP3炎性小体在肝衰竭发病过程中发挥的作用及其具体调节机制还缺乏足够研究。NLRP3炎性小体的激活分为两个步骤:首先,包含脂多糖在内的多种细菌信号,可通过NF-κB依赖途径上调NLRP3的表达,随后可通过多种途径完成NLRP3炎性小体的活化。其中一条重要的途径与硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)相关。在多种诱因刺激下,TXNIP与原本结合的硫氧还蛋白解离,并与NLRP3结合,触发其活化,调节NLRP3的作用,但这种现象在肝衰竭中发挥的作用仍无定论。据报道内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与TXNIP-NLRP3炎性小体通路之间关系密切。ERS可通过激活NF-κB通路进而诱发细胞内pro-IL-1β的成熟与释放,该过程依赖于TXNIP介导的NLRP3炎性小体的激活过程。我们的团队在之前的研究中也已证实ERS可通过调节过氧化物酶增殖物受体α功能在急性肝衰竭的发病过程中发挥重要作用,但ERS在急性肝衰竭发病过程中对TXNIP-NLRP3炎性小体通路的调节作用目前仍缺乏相关研究。第一部分HBV相关慢加急性肝衰竭患者NLRP3炎性小体活化及TXNIP表达水平目的:比较慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者及早期HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV related acute on chronic liver failure,HBV-ACLF)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中NLRP3炎性小体相关分子、TXNIP mRNA表达水平及外周血中NLRP3炎性小体激活标志IL-18、IL-1β浓度初步探讨肝衰竭患者体内NLRP3炎性小体活化与TXNIP表达情况。方法:1共纳入研究对象30例,其中CHB组、早期HBV-ACLF组及健康对照(Control)组各10例。慢性乙型肝炎、早期HBV相关慢加急性肝衰竭诊断分别符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》及《肝衰竭诊疗指南(2012版)》。同时,排除合并其他病毒性肝炎重叠感染及其他病毒感染者,合并酒精性肝病、自身免疫性疾病等其他疾病者,妊娠者,合并其它系统严重疾病者。2全自动生化分析仪检测各组研究对象生化学指标。3留取各组研究对象外周血,分离PBMC,应用实时荧光定量聚合酶链式反应检测PBMC中NLRP3炎性小体相关分子(ASC、NLRP3、Caspase-1)及TXNIP mRNA表达水平,并分析其表达与肝损伤指标之间关系。结果:1.各组研究对象人口学特征及生化学指标特点HBV-ACLF组ALT、AST、TB、DB水平明显高于CHB组及Control组,CHB组TB水平明显高于Control组,P<0.05或0.01。2.HBV-ACLF患者PBMC中NLRP3炎性小体相关分子及TXNIP表达情况HBV-ACLF患者PBMC中ASC mRNA,NLRP3 mRNA,Caspase-1 mRNA较Control组及CHB组明显升高,校正后P均<0.01;IL-18、IL-1βmRNA表达水平明显高于Control组及CHB组,P均<0.01。HBV-ACLF组外周血中IL-18、IL-1β浓度较Control组、CHB组明显升高,P均<0.01。HBV-ACLF患者PBMC中TXNIP mRNA水平明显高于Control组及CHB组P均<0.01。3.PBMC中TXNIP mRNA及外周血IL-1β浓度与临床指标相关性研究对象PBMC中TXNIP mRNA相对表达量与ALT、AST、TB、DB水平有明显正相关性(r=0.8161,P<0.01;r=0.7597,P<0.01;r=0.8171,P<0.01;r=0.7972,P<0.01);外周血中IL-1β浓度与ALT水平间呈正相关(r=0.78,P<0.01)。小结:HBV相关慢加急性肝衰竭患者存在明显NLRP3炎性小体活化与TXNIP高表达现象,且与肝脏炎症损伤相关。第二部分TXNIP-NLRP3炎性小体通路在小鼠急性肝衰竭模型中作用目的:构建小鼠急性肝衰竭模型,应用腺相关病毒载体转染TXNIP shRNA敲低部分小鼠TNXIP表达,探讨TXNIP-NLRP3炎性小体通路在小鼠急性肝衰竭发病中的作用。方法:1 AAV-TXNIP shRNA转染小鼠健康清洁级8周龄雄性BALB/c小鼠60只,体重(20-25)g,随机分为正常对照组(NC)20只,转染TXNIP sh RNA敲低TXNIP表达组(TXNIP shRNA)20只,转染Control shRNA对照组(Control shRNA)20只。各组中取3只,应用4%水合氯醛按麻醉后处死,留取相应组织标本-80℃保存,用于后期TXNIP表达敲低效率检测。余下小鼠按照分组给予D-GalN/LPS观测TXNIP敲低后对D-GalN/LPS诱导的急性肝衰竭的作用。2 D-Gal N/LPS介导小鼠急性肝衰竭模型建立健康清洁级12周龄雄性BALB/c小鼠27只,体重(20-25)g,随机分为健康对照组(NC)10只及急性肝衰竭模型组(D-GalN/LPS)17只。与1中描述TXNIP shRNA组、Control shRNA组小鼠一起给予相应药物处理:NC组小鼠给予腹腔注射PBS;D-Gal N/LPS组、TXNIP shRNA组及Control shRNA组小鼠给予腹腔注射溶于PBS的D-GalN/LPS。每组中各取10只,观察其一般状态及24小时生存率,剩余小鼠于D-GalN/LPS注射后6小时处死,留取血浆及相应组织标本,用于HE、TUNEL染色,及qPCR、Western Blot检测。结果:1.应用AAV转染TXNIP sh RNA可明显抑制小鼠体内TXNIP表达以AAV为载体,搭载TXNIP sh RNA转染小鼠,小鼠组织中TXNIP mRNA及蛋白表达水平较正常对照组小鼠均有明显下降。其中肝脏表达水平抑制最为明显,P均<0.01。2.抑制小鼠TXNIP可对D-GalN/LPS诱导的ALF发挥保护作用转染TXNIP shRNA小鼠接受D-GalN/LPS腹腔注射后10小时开始出现死亡,最终24小时生存率60%,明显高于急性肝衰竭模型组小鼠,P=0.044;生化学指标检测显示转染TXNIP shRNA组小鼠ALT、AST水平较急性肝衰竭模型组小鼠明显下降,P均<0.01;HE染色显示转染TXNIP sh RNA组小鼠肝损伤较急性肝衰竭模型组小鼠有明显改善。3.抑制小鼠TXNIP可减少ALF小鼠肝细胞凋亡应用TUNEL染色检测肝细胞凋亡,结果显示转染TXNIP shRNA组小鼠肝组织中TUNEL阳性细胞计数较急性肝衰竭模型组小鼠明显减少,P<0.01。4.抑制小鼠TXNIP对NLRP3炎性小体活化影响转染TXNIP sh RNA组小鼠肝组织中NLRP3炎性小体相关分子mRNA及蛋白表达水平较急性肝衰竭模型组小鼠明显下降,且NRLP3炎性小体相关分子ASC与NLRP3之间相互作用较急性肝衰竭组小鼠明显下降;NLRP3炎性小体活化标志IL-18、IL-1β外周血浓度明显低于急性肝衰竭组。P均<0.01。小结:1.应用D-Gal N/LPS腹腔注射小鼠可成功构建ALF小鼠模型。2.急性肝衰竭小鼠NLRP3炎性小体活化明显。3.以AAV为载体向小鼠体内转染TXNIP sh RNA可显著抑制小鼠体内TXNIP表达,各脏器中肝脏TXNIP表达受抑最为明显。4.抑制TXNIP表达可明显减少小鼠体内NLRP3炎性小体活化,并减轻小鼠肝细胞损伤,改善ALF小鼠24小时生存率,提示TXNIP-NLRP3炎性小体通路在调节ALF发病过程中发挥作用。第三部分内质网应激对急性肝衰竭小鼠TXNIP-NLRP3炎性小体通路的影响目的:应用细胞共培养模型观测内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)对TXNIP-NLRP3炎性小体功能的影响。方法:首先应用qPCR及Westernblot检测急性肝衰竭模型小鼠体内ERS,随后应用磁珠分选法筛选急性肝衰竭小鼠原代脾巨噬细胞(F4/80~+细胞定义为巨噬细胞),应用Transwell构建小鼠原代脾巨噬细胞与小鼠肝细胞系AML-12细胞共培养体系,给予ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)或DMSO处理各组细胞,通过该细胞模型以观测ERS对TXNIP-NLRP3炎性小体功能的影响。具体分组及处理方式为:(1)DMSO+AML-12+NC Mφ组;(2)TM+AML-12+NC Mφ组;(3)DMSO+AML-12+TXNIP shRNA Mφ组;(4)TM+AML-12+TXNIP sh RNA Mφ组。结果:1.急性肝衰竭小鼠ERS标志物GRP78、CHOP mRNA及蛋白表达明显升高;敲低TXNIP表达后,ERS缓解。2.应用TM处理AML-12与小鼠原代脾巨噬细胞共培养模型,可诱发AML-12细胞ERS。AML-12细胞ERS标志物GRP78、CHOP mRNA及蛋白表达水平较对照组明显升高,P<0.01。3.激活ERS使敲低TXNIP发挥的保护作用逆转CCK8检测结果显示应用TM诱导AML-12细胞ERS后,AML-12+TXNIP shRNA Mφ共培养体系与AML-12+NC Mφ共培养体系中AML-12细胞存活率之间无明显差异,且应用TUNEL染色发现两组细胞凋亡无明显差异。4.激活ERS使敲低TXNIP导致的NLRP3炎性小体活化受抑现象消失。应用TM处理后,AML-12+TXNIP sh RNA Mφ共培养体系与AML-12+NC Mφ共培养体系中AML-12细胞NLRP3炎性小体相关分子mRNA及蛋白表达水平间无差异,上清中IL-18、IL-1β浓度无差异。小结:1.ALF小鼠肝组织ERS明显增强,且抑制TXNIP表达可明显缓解肝细胞ERS程度,肝细胞凋亡减少,提示抑制TNXIP可通过缓解小鼠肝细胞ERS减少肝细胞凋亡,对ALF临床诊治提供了新的靶点。2.应用TM激活细胞ERS可使TXNIP敲低所介导的NLRP3炎性小体激活抑制作用逆转。3.应用TM激活细胞ERS可使TXNIP敲低所介导多细胞保护作用消失。4.ERS可在急性肝衰竭发病过程发挥作用,可能与ERS对TXNIP-NLRP3炎性小体通路调节功能相关。结论:1.HBV相关慢加急性肝衰竭患者存在明显NLRP3炎性小体活化与TXNIP高表达现象,且与肝脏炎症损伤相关。2.ALF小鼠NLRP3炎性小体活化明显,敲低小鼠TXNIP表达可明显抑制ALF小鼠NLRP3炎性小体活化水平,减轻NLRP3炎性小体相关肝脏损伤,改善其生存率。3.ALF小鼠肝细胞ERS明显,敲低小鼠TXNIP可明显缓解肝细胞ERS程度,肝细胞凋亡减少。应用ERS激活剂重新激活ERS可使TXNIP敲低介导的NLRP3炎性小体活化受抑现象及其相关保护作用消失。4.TXNIP-NLRP3炎性小体通路在肝衰竭发病过程中发挥作用,其功能受到ERS调节。