论文部分内容阅读
疟疾目前仍然是最主要的全球健康威胁之，每年因疟疾感染而死亡的人数约62.7万人，至今临床上尚无高效可行的疟疾疫苗问世。红前期阶段为疟原虫入侵人体的首个时期，阻断疟原虫子孢子在肝脏中发育和繁殖，可防止肝期裂殖子入血感染红细胞，从而出现临床症状，针对红前期设计的疫苗可从源头上控制疟疾感染。目前认为，最为有效的红前期疟疾疫苗是减毒子孢子疫苗，减毒子孢子诱导的CD8+T细胞免疫反应是其最主要的保护性免疫机制，也成为衡量疟疾疫苗有效性的金标准。然而，减毒子孢子的大量获得及运输、保存方面存在的困难，使其大规模的生产及现场应用受到限制，亚单位疫苗将会成为新代疫苗的主要研发方向，但至今仅鉴定出少数的红前期疫苗候选抗原，因此，迫切需要发展新的高效红前期保护性抗原筛选方法，筛选出更多介导CD8+T细胞免疫反应的靶抗原，进步认识清除感染细胞的免疫机制，为研制出高效的红前期疟疾疫苗奠定坚实基础。本研究首先通过DNA疫苗评价了约氏疟原虫（Plasmodium yoelii）候选抗原PyTmp21在小鼠体内诱导的红前期保护作用。其次，利用肝脏晚期发育停滞P.yoeliifabb/f-基因减毒子孢子疫苗小鼠保护性模型，采用水动力法尾静脉注射（Hydrodynamic tail vein injection, HTVI）表达特异性抗原的荧光素酶报告融合质粒DNA入小鼠肝细胞内，结合活体成像系统（In Vivo Imaging System, IVIS）实时监测荧光素酶报告基因在免疫小鼠肝细胞内表达量，从而鉴定减毒子孢子疫苗诱导特异性CD8+T细胞免疫应答杀伤肝细胞的靶抗原，为进步筛选Pyfabb/f-基因减毒子孢子诱导保护性免疫相关的红前期抗原建立技术平台。最后，利用该技术平台探讨Pyfabb/f-基因减毒子孢子能否诱导产生针对新候选抗原PyTmp21的特异性细胞免疫反应并清除表达该抗原的肝细胞，从而评价PyTmp21是否为潜在的减毒子孢子疫苗诱导的保护性相关抗原。主要研究结果如下：一、PyTmp21DNA疫苗免疫后可抑制小鼠红前期疟原虫感染的肝脏虫荷量及诱导消除性保护作用为了鉴定新候选抗原PyTmp21能否在体内诱导保护性免疫，我们利用DNA疫苗免疫小鼠后发现，PyTmp21免疫可显著减少子孢子攻击感染小鼠肝脏内的疟原虫虫荷量及诱导60%消除性保护效率。二、建立HTVI/IVIS筛选Pyfabb/f-基因减毒子孢子诱导的特异性CD8+T细胞免疫反应相关保护性抗原的研究平台1、通过HTVI法将PyCSP-Luc重组质粒注射入正常小鼠体内，IVIS系统观察证实质粒DNA在小鼠肝脏内持续、稳定高表达，并可实时监测与荧光素酶融合的目的蛋白在肝脏的表达量。通过流式细胞术证实HTVI注射后质粒DNA主要表达在肝细胞内，为目的蛋白的表达定位提供依据。2、利用Pyfabb/f-基因减毒子孢子免疫小鼠诱导产生完全保护性免疫反应，HTVI将PyCSP-Luc质粒DNA攻击免疫小鼠，IVIS观察证实免疫小鼠肝脏内荧光素酶表达量减低。进步抗体耗竭实验证实CD8+T细胞介导了清除表达靶抗原的肝细胞。再者，对质粒攻击后的免疫小鼠肝脏淋巴细胞进行流式细胞内染色发现，CSP特异性CD8+T细胞数量明显增加且IFN-γ分泌水平增加。本实验表明Py fabb/f-基因减毒子孢子免疫小鼠可诱导产生CSP特异性CD8+T细胞免疫反应，并介导清除表达该抗原表位的肝细胞，HTVI与IVIS相结合技术可作为有效的工具用于筛选基因减毒子孢子诱导CD8+T细胞清除肝细胞的靶抗原。三、利用HTVI/IVIS研究平台鉴定Py fabb/f-基因减毒子孢子诱导保护性免疫相关的红前期抗原为了鉴定基因减毒子孢子疫苗保护模型诱导的保护性免疫相关红前期抗原，我们利用HTVI/IVIS研究平台检测Pyfabb/f-基因减毒子孢子能否诱导产生针对新候选抗原PyTmp21的特异性T细胞免疫反应并杀伤表达该抗原的肝细胞。我们发现2次Pyfabb/f-子孢子同源免疫后，HTVI法将PyTmp21-Luc质粒DNA攻击免疫小鼠，未能观察到肝脏内荧光素酶表达量减低现象。然而，利用DNA+子孢子或子孢子+DNA异源性免疫-加强免疫策略发现，PyTmp21-Luc质粒DNA攻击免疫小鼠后其在肝脏的表达量明显减低，提示Pyfabb/f-减毒子孢子可诱导针对PyTmp21抗原的特异性免疫反应并杀伤表达该抗原的肝细胞。本实验表明，同源性减毒子孢子免疫小鼠后可能主要诱导产生针对优势抗原CSP的有效免疫反应，而不足以诱导产生针对非CSP抗原的免疫反应，因此，我们通过异源性免疫-加强免疫策略证实Pyfabb/f-基因减毒子孢子可诱导产生有效的PyTmp21抗原特异性T细胞免疫反应，PyTmp21抗原为潜在的减毒子孢子疫苗诱导的保护性相关抗原。我们的研究显示HTVI/IVIS方法可用于检测基因减毒子孢子疫苗诱导的CD8+T细胞特异性杀伤肝细胞的靶抗原。采用异源性免疫-加强免疫策略证实Pyfabb/f-基因减毒子孢子疫苗诱导了针对PyTmp21抗原的特异性免疫反应，并清除了表达该抗原的肝细胞，PyTmp21作为新的红前期抗原参与减毒子孢子疫苗诱导的保护性免疫反应。异源性免疫-加强免疫策略结合HTVI/IVIS技术可作为有效的工具用于筛选减毒子孢子全虫疫苗诱导的新红前期非CSP保护性抗原，为进步认识减毒全虫疫苗的保护性免疫机制、筛选出更多的亚单位疫苗候选抗原并设计出高效的疟疾疫苗奠定基础。