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研究背景恙虫病(scrub typhus)是由恙虫病东方体(Orientia tsutusgamushi, Ot)感染引起的以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为主要临床表现的一种自然疫源性疾病,经恙螨叮咬传播。恙虫病在我国发生已久,1986年以前,该病仅在我国长江以南地区有报道流行,流行季节主要为夏季。夏季型恙虫病可由Karp型、Kato型和JG型Ot引起,该三型Ot所引起的恙虫病的并发症常常比较严重。1986年以来,我国北方包括山东省在内的许多地区陆续出现恙虫病疫源地的报道,流行季节主要为秋冬季。目前,流行于北京市、天津市、江苏省、山西省、安徽省、河南省和山东省秋冬季节的恙虫病被称作秋冬型恙虫病。研究发现,北方地区的恙虫病血清型以Gilliam型为主,基因型以Kawasaki型的报道居多。恙虫病的严重程度由自限性疾病至死亡性疾病不等,主要与患者所感染的Ot类型、诊断及用药及时与否有关。恙虫病常见的严重并发症有脑炎、肺炎、心肌炎、急性肾功能衰竭、弥散性血管内凝血等,也少数患者会出现急性听力功能丧失、急性呼吸窘迫综合征等,严重者会导致死亡。阐明重症恙虫病的危险因素对有效预防和控制恙虫病严重并发症和死亡病例的发生有重要意义。研究目的1.根据近年来山东地区的Ot优势株,确定其型特异性抗原(type-specific antigen,TSA)编码基因序列,明确其与国际参考株间核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的差异及同源性关系。2.阐明山东地区由Ot优势株所引起的恙虫病主要临床特点,为秋冬型恙虫病的诊断治疗提供线索。3.探索重症恙虫病的影响因素,为有效预防和控制恙虫病严重并发症和死亡病例的发生提供科学依据。研究方法根据山东省疾病报告信息系统(Shandong Diseases Reporting Information System, SDRIS)的恙虫病监测资料,于2010年至2013年间,利用问卷调查的方式在淄博沂源县、临沂蒙阴县等调查点的监测医院收集恙虫病患者病例信息,并采取恙虫病病例急性期抗凝血和/或焦痂标本,提取DNA后,利用巢式PCR方法针对恙虫病东方体Ot 56kDa TSA的基因编码序列进行扩增和测序,并将所得序列与GenBank中的参考序列通过Mega5.0软件进行序列比对,利用neighbor-joining (NJ)法构建系统进化树。通过Lasergene7.1软件对Ot 56kDa TSA的碱基序列及其推导的氨基酸序列进行同源性分析,确定近年来山东地区的Ot优势株是否出现变异,并对Ot优势株所引起的恙虫病的主要临床特征加以分析比较。自所收集的恙虫病病例中,根据重症恙虫病的纳入标准确定重症恙虫病病例,并与非重症病例进行病例对照研究。利用SPSS17.0软件采用单因素、多因素条件Logistic回归分析方法,对重症恙虫病的危险因素进行分析,以OR值、95%可信区间(confidence interval,CI)值表示疾病与暴露之间的关联强度。显著性检验水平采用α=0.05。结果1.病人中Ot基因型分布情况本研究自43例恙虫病病例中采集到的急性期抗凝血或焦痂标本经巢式PCR扩增并测序后,将获得的Ot序列与国际参考序列进行系统发育分析。分析结果显示,本研究中的43条序列全位于类Kawasaki枝,各序列与Kawasaki株的同源性自95.1%至96.4%不等,相互之间的同源性自98.5%至100%不等。其中的四条序列：SH1002、SH1307、SH1306和SH1309位于单独的四支小分枝上,与其余39株的同源性相对较低,代表了四条新的基因序列。2.类Kawasaki型Ot 56kDa TSA分子结构分析本研究扩增了开放读码框架(open reading frame, ORF)基因序列全长的80.11%,共1273 bp的片段长度。扩增区域共编码了417个氨基酸,其中4个可变区(VDⅠ-VDⅣ)所编码的氨基酸数量分别为25、22、28和39个,其中VDⅠ、VDⅡ、VDⅣ三个可变区的氨基酸序列与Kawasaki相应三个可变区的氨基酸序列的一致性分别为96%、81.82%、94.87%,高于与另外三株国际标准株(Karp、Kato、Gilliam)相应区域的一致性；VDⅢ的氨基酸序列与Kawasaki相应区域的一致性为67.86%,低于与Gilliam的VDⅢ氨基酸序列的一致性(78.57%)。基于各可变区的碱基序列构建的系统发育树分析结果与氨基酸分析结果一致。3.恙虫病患者临床特征类Kawasaki型Ot所引起的恙虫病病例以发热、焦痂或溃疡、头痛、皮疹、寒战、疲乏等为主要的临床表现。本研究的43例恙虫病病例中,42例出现焦痂体征。其中腹股沟、会阴、腋窝和腰部是焦痂的好发部位。病人主要的实验室指标中,白细胞增多和减少病例分别占总病例数的18.6%和4.7%；中性粒细胞减少和血小板减少症患者分别占总病例数的35.9%和23.1%；平均血沉速率为18.43±11.62mm/h。4.重症恙虫病危险因素单因素Logistic回归分析结果显示如下8个因素有统计学意义：①抗生素使用前疾病持续天数；②淋巴结肿大；③皮疹；④血小板计数<100×109；⑤中性粒细胞比率<50%；⑥淋巴细胞比率>40%；⑦总胆红素>0.024；⑧直接胆红素>0.009mmol/L。多因素Logistic逐步回归分析中,结果表明,如下四个因素为重症恙虫病的影响因素：①抗生素使用前疾病持续天数>4.5天(OR=2.287,95%CI=(1.096-4.770),P=0.027)；②淋巴结肿大(OR=2.438,95%CI=(1.090-5.458),P=0.014)；③皮疹(OR=3.694,95%CI=(1.300-10.495),P=0.014)；④血小板计数<100×109/L(OR=2.287,95%CI=(1.002-4.946),P=0.050)。结论1.本研究中的43条序列均位于类Kawasaki枝,与Kawasaki原型株的相似度白95.1%至96.4%不等,提示山东地区人群中存在的Ot感染仍以类Kawasaki型为主。系统发育分析发现4条序列(SH1002,SH1306,SH1309,SH1307)位于系统进化树中独立的小分支上,代表了4条新的基因序列,提示Ot 56kDa TSA序列可能出现了变异。2.类Kawasaki型Ot与Kawasaki型Ot之间的变异主要发生在VDⅢ区,该区的氨基酸序列与Kawasaki相应区域的一致性为67.86%。3.类Kawasaki型Ot所引起的焦痂发生率高,可为临床诊断提供重要线索。4.多因素Logistic回归分析发现有效抗生素使用前疾病持续时间长、皮疹的发生、淋巴结肿大的发生和血小板计数<100×109/L是重症恙虫病的危险因素。诊断技术的改进和恙虫病及时确诊并及时使用特效药可有效预防重症恙虫病的发生。