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研究背景
慢性疼痛影响大约1/3的人群，是急需要解决的医学问题和社会问题。肌筋膜疼痛综合征(Myofascial pain syndrome，MPS)是临床上最常见的慢性疼痛性疾病之一。其特点是在患者相应的肌筋膜部位存在一个或多个肌筋膜扳机点(Myofascial trigger points，MTrPs)。MTrPs是由许多异常收缩的局限小点，即由异常收缩的肌小节组成，体检可于相应的骨骼肌部位触及到紧绷肌带(Taut bands)或者硬结(Nodules)。
肌肉扳机点的持续收缩活动导致局部缺血、缺氧和伤害性感受器的神经病理性改变，进而导致疼痛敏感化，是导致慢性疼痛反复发作的重要原因。因此，阐明其病理生理机制具有重要的临床意义。目前，对MTrPs的临床特征已得到广泛的研究，但MTrPs的具体病理生理机制尚未得到全面的证实。
课题首次应用RNA测序(RNA-seq)和蛋白芯片等高通量技术对MPS病人斜方肌MTrPs组织进行分析。然后通过构建MTrPs动物模型，验证与MTrPs相关的分子靶点的功能，进一步阐释MTrPs发生发展的病理生理机制，为寻找MPS治疗的新靶点提供理论依据。
研究目的:
第一部分肌筋膜扳机点的转录组学分析
探究MPS患者斜方肌MTrPs组织的转录组改变，阐释其发生发展中的关键基因和通路。
研究方法:
1.患者的选择:本研究获得山东大学齐鲁医院研究伦理委员会批准。所有受试者均于门诊招募并签署书面知情同意书。根据关于MPS诊断标准的国际共识，本研究中MPS患者纳入标准如下:(A)斜方肌中存在紧绷肌带或结节;(B)按压硬结引起疼痛或牵涉痛;(C)通过刺激MTrPs的硬结可再现受试者的疼痛;以及(D)疼痛至少持续1个月。排除标准为可能影响疼痛敏感性的疾病，如全身炎症性疾病、颈部外伤、神经性疼痛、代谢性疾病、恶性肿瘤等，或参与前1周内使用止痛药、活检失败等。
2.样本的采集:本研究使用一次性SuperCore微创切割活检针从MPS患者斜方肌结节中穿刺活检MTrPs肌肉样本。所有参与者由同一名在MPS领域拥有20多年临床经验的医疗人员进行操作。确定MTrPs位置后，用0.5％利多卡因溶液1.5ml皮下注射麻醉，以减轻皮肤穿刺点的疼痛。穿刺前，使用拇指和食指向上提起紧绷肌带或结节以防止气胸。将活检针刺入肌肉，当痛感被触发或发生局部抽搐反应时，针尖慢慢向前推进3mm(活检针针尖距离针体组织凹槽距离为3mm)，使包含有MTrPs的肌肉组织正对凹槽部位。扣动扳机进行活检。将组织立即在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻，并保存在-80℃。
3.文库制备与RNA测序:提取总RNA后，进行RNA质检。质检合格后，根据TruSeqTMRNA样品制备指南，合成文库。用Qubit(R)2.0荧光仪对纯化的文库进行定量，然后利用Agilent2100生物分析仪进行进一步验证，最后在IlluminaNovaSeq6000上测序。处理原始数据后，利用RPKM值衡量基因的表达量。
4.差异表达基因的识别:在得到基因或转录本的FPKM表达值后，对组间基因表达进行差异分析。差异mRNA和LncRNA的筛选标准均为:Pvalue＜0.05且FC2，即表达值变化倍数为上调2倍(FC≥2)或下调2倍(FC≤0.5)。
5.功能富集分析:基于GO和KEGG数据，对差异基因进行富集分析，找出差异基因相关的生物学功能和信号通路。以Pvalue＜0.05为阈值筛选差异表达的富集分析结果。
研究结果:
1.DEmRNAs结果显示，与对照组相比，MTrPs组织中有2662mRNAs的表达明显上调，4092mRNAs的表达明显下调。DELncRNAs结果显示，与对照组相比，MTrPs组织中有767个LncRNAs表达上调，2356个LncRNAs表达下调。
2.GO和KEGG分析结果显示，在DEmRNAsGO富集分析中，差异基因功能主要富集在代谢过程、炎症反应、生长因子反应、骨骼肌收缩、酪氨酸激酶活性调节等方面;KEGG信号通路分析中，差异基因富集结果主要聚焦在自噬、生长因子信号通路、炎症相关通路、血管平滑肌收缩、糖酵解/糖异生、细胞凋亡及代谢等方面。DELncRNAsGO富集分析中，靶基因功能主要富集在RasGTPase结合、ATP结合、激酶磷酸酶活性、糖酵解及各类物质代谢过程、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路等;KEGG通路分析显示，差异基因主要富集于炎症相关信号通路、脂类及氨基酸等代谢过程、Jak-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路、趋化因子信号通路、血管平滑肌收缩等。
研究结论:
1.MTrPs组织中，mRNA与LncRNA表达谱发生显著改变。
2.生物信息学分析发现:多种信号通路和功能因子可能参与了MTrPs的病理生理过程。
第二部分酪氨酸激酶在肌筋膜扳机点的表达和机制初探
研究目的:
1.检测MPS患者斜方肌MTrPs部位肌肉组织与对照组肌肉组织形态学差异。
2.利用磷酸化蛋白芯片检测MTrPs与对照组肌肉组织中酪氨酸激酶(TKs)家族蛋白的磷酸化表达差异，并进一步验证差异表达蛋白，探究其在MTrPs中的功能。
研究方法:
1.HE染色与Masson染色:将穿刺组织经过固定、包埋制作蜡块，然后制成石蜡切片。再通过脱蜡、水化、染色、封片等过程，进行HE染色与Masson染色，观察两组组织形态学差异。
2.RayBiotech芯片检测:样本提取总蛋白后，使用了RayBiotech人磷酸化蛋白检测试剂盒(AAH-PRTK-G1)进行芯片检测，蛋白含量的检测根据试剂盒的说明进行。首先，将封闭缓冲液100μl加至每个孔中，并在室温下轻轻摇动孵育30分钟，然后倒出每个孔的封闭缓冲液。在确保所有缓冲液去除后，各孔中加入各个样品100μl，4℃孵育过夜。第二天室温下复温30min，加入洗涤缓冲液洗涤。抽去洗液后，将100μl1x生物素偶联的抗磷酸酪氨酸抗体加入每个相应的孔中，并在室温下轻轻摇动孵育2h。加入洗涤缓冲液洗涤后，将100μl结合荧光染料的链霉亲和素添加至孔中，洗涤3次并完全干燥，使用激光扫描仪检测。
3.Westernblot验证差异蛋白表达:提取总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，通过电转印将蛋白转印至PVDF膜。室温下封闭90min、一抗4℃孵育过夜、二抗室温孵育90min后，进行化学显影。
4.免疫组织化学染色进一步验证差异蛋白表达及定位:石蜡切片经过脱蜡水化、抗原修复后，进行封闭、孵育一抗和二抗、DAB显色和苏木素复染等步骤，封片后显微镜下观察差异蛋白表达及定位。
研究结果:
1.显微镜下观察发现，对照组肌纤维大小均匀，呈多边形，横截面和纵向空间排列规则。MTrPs中的肌纤维在横断面上显示大小不等的圆形或椭圆形，纵切面可见锥型肌纤维，横切面和纵切面的肌纤维间距均增加。另外，MTrPs部位异常收缩肌纤维未见伴有明显炎症细胞浸润与纤维化现象。
2.蛋白芯片检测MTrPs和对照组织的TKs蛋白磷酸化的表达发现，在71个TKs中，与对照组相比，有15个蛋白磷酸化水平在MTrPs组织中表达升高(P＜0.05)，2个蛋白磷酸化水平表达降低(P＜0.05)。EphB家族中p-EphB1(P＜0.05)、p-EphB2(P＜0.05)、和p-EphB3(P＜0.001)在MTrPs组织中的表达明显高于对照组。
3.Westernblot实验证实，与对照组相比，MTrPs组织中p-EphB的表达明显增加(P＜0.05)。免疫组织化学分析显示p-EphB在MTrPs异常收缩肌纤维的细胞膜上表达增加。
4.相关性分析发现，MPS患者MTrPs组织中p-EphB1(r=0.723，n=11，P＜0.05)、p-EphB2(r=0.610,n=11,P＜0.05)、p-EphB3(r=0.670,n=11，P＜0.05)、p-PDGFRa(r=0.711,n=11,P＜0.05)和p-TRKB(r=0.640,n=11,P＜0.05)的表达水平与MPS患者斜方肌MTrPs的疼痛数字评分量表(NRS)评分显著相关。
研究结论:
1.在MPS患者斜方肌MTrPs区域发现异常收缩的肌纤维，这与前期MTrPs研究假说一致。
2.蛋白芯片检测MTrPs和对照组织的TKs家族蛋白磷酸化的表达发现，两组间存在多个差异表达蛋白。其中p-EphB在MTrPs的异常收缩肌纤维中表达升高，并且与疼痛数字评分显著相关。EphB可能参与MTrPs的病理生理过程，需要进行更深一步探究。
第三部分关于EphrinB1/EphB1信号通路参与介导MTrPs疼痛的研究
研究目的:
1.SD大鼠腓肠肌内梯度注射EphB1配体激动剂EphinB1-Fc，分析EphrinB1/EphB1信号通路在肌痛外周敏化中的作用。
2.构建MTrPs动物模型，探索EphrinB1/EphB1信号在MTrPs中的表达及其作用机制。
研究方法:
1.实验动物:动物实验经过山东大学实验动物伦理委员会批准。研究选用6周龄雄性SD大鼠，体重约200-250g，实验大鼠在室温24℃，相对湿度20％-30％，光照12小时/暗12小时的条件下饲养。每个笼子中有三只动物，这些动物可以自由获得食物和水。
2.局部注射:在短暂异氟醚麻醉下，将不同浓度的EphrinB1-Fr(0.02，0.2，2μg/μl，30μl，i.m，n=4)注入大鼠左侧腓肠肌，以相同体积的PBS作为对照，观察大鼠腓肠肌注射EphrinB1-Fc的直接致痛效应。为进一步研究EphrinB1是否通过其受体EphB1发挥作用。左侧腓肠肌注射EphrinB1-Fc(2μg/μl，30μl，i.m，n=6)前，在同一部位注射EphB1抑制剂EphB1-Fr(2μg/μl，30μl，i.m，n=6)，而对照组仅给予等量的PBS。所有大鼠均于注药前0.5h、注药后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h测定左腿腓肠肌压痛阈值。
3.构建MTrPs动物模型:选用6周龄雄性SD大鼠。环境适应一周后，对SD大鼠左侧腓肠肌采用每周一次钝挫击打联合跑台离心训练的方式干预8周，然后进行4周恢复，建立大鼠MTrPs模型。即每周用自制的动能为2.352J的棒状装置击打标记好的左侧腓肠肌，第二天将大鼠放入无菌跑步机上，向下角度为-16°，速度为16m/min，持续1.5h。观察大鼠肢体运动、结节变化和压痛阈值改变。根据以下标准确定MTrPs造模成功:1)触诊发现局部有肌紧张带或结节;2)结节上的压痛阈值明显降低;3)通过针刺可以诱发局部抽搐反应。
4.药理学实验:验证大鼠MTrPs造模成功后，将大鼠随机分为三组(n=6):MTrPs+PBS组，MTrPs+EphB-Fr组和Control+PBS组。MTrPs+EphB-Fr组在大鼠左腿腓肠肌MTrPs注射EphB抑制剂EphB-Fr(2ug/ul，30μl×3点)，同时MTrPs+PBS组和Control+PBS组注射与抑制剂体积相同PBS为对照，在肌肉注射后0.5h、1h、2h、4h、8h和24h，用电子压痛仪测量结节部位压痛阈值。
5.Western检测蛋白表达:收集组织并提取总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后通过电转印将蛋白转印至PVDF膜。室温下封闭90min、一抗4℃孵育过夜、二抗室温孵育90min后，进行化学显影。检测p-EphB及其相关蛋白的表达。
研究结果:
1.肌肉梯度注射EphB1配体激动剂EphrinB1-Fc产生了时间依赖性和剂量依赖性痛觉过敏，同时脊髓背角c-Fos蛋白表达增加。注射30min后，压痛阈值开始呈剂量依赖性降低，疼痛反应持续至少4h。注射24小时后，伤害性阈值恢复到基线水平。EphB1-Fc预处理可部分阻止EphrinB1-Fc引起的压痛阈值降低。
2.MTrPs大鼠模型结节、压痛阈值、和形态学变化:造模组大鼠于造模开始2周后，在腓肠肌中部触诊发现紧绷结节。第3周开始，结节部位压痛阈值与对照组相比出现降低，这种差异持续了12周(P＜0.05)。与此同时，对照组结节触诊及压痛阈值并没有发生变化(P＞0.05)。HE染色后，显微镜下观察发现对照组大鼠肌肉组织横切面可见肌纤维大小均匀，呈现规则的多边形，横断间隙排列规则整齐。而MTrPs横切面可见大而圆的肌细胞，也可见明显的炎性细胞浸润。
3.与对照组相比，MTrPs造模组大鼠中的p-EphB表达明显升高(P＜0.05)。肌肉注射EphB1-Fr可使MTrPs造模组大鼠的压痛阈值部分恢复，这种恢复持续了近4小时。而MTrPs+PBS组大鼠及Control+PBS组大鼠注射PBS后对压痛阈值未产生明显影响。Westernblot实验检测发现，MTrPs+EphB-Fr组给予Eph-Fr(2.5 mg/ml)后不仅抑制p-EphB的表达，同时p-NR2B的表达也降低。
研究结论:
EphrinB1可以通过其高亲和力受体EphB1诱导肌肉痛觉过敏。同时EphB1在与MTrPs相关的外周伤害性信息的调制中发挥重要作用，可能是MPS治疗的重要靶点之一。
慢性疼痛影响大约1/3的人群，是急需要解决的医学问题和社会问题。肌筋膜疼痛综合征(Myofascial pain syndrome，MPS)是临床上最常见的慢性疼痛性疾病之一。其特点是在患者相应的肌筋膜部位存在一个或多个肌筋膜扳机点(Myofascial trigger points，MTrPs)。MTrPs是由许多异常收缩的局限小点，即由异常收缩的肌小节组成，体检可于相应的骨骼肌部位触及到紧绷肌带(Taut bands)或者硬结(Nodules)。
肌肉扳机点的持续收缩活动导致局部缺血、缺氧和伤害性感受器的神经病理性改变，进而导致疼痛敏感化，是导致慢性疼痛反复发作的重要原因。因此，阐明其病理生理机制具有重要的临床意义。目前，对MTrPs的临床特征已得到广泛的研究，但MTrPs的具体病理生理机制尚未得到全面的证实。
课题首次应用RNA测序(RNA-seq)和蛋白芯片等高通量技术对MPS病人斜方肌MTrPs组织进行分析。然后通过构建MTrPs动物模型，验证与MTrPs相关的分子靶点的功能，进一步阐释MTrPs发生发展的病理生理机制，为寻找MPS治疗的新靶点提供理论依据。
研究目的:
第一部分肌筋膜扳机点的转录组学分析
探究MPS患者斜方肌MTrPs组织的转录组改变，阐释其发生发展中的关键基因和通路。
研究方法:
1.患者的选择:本研究获得山东大学齐鲁医院研究伦理委员会批准。所有受试者均于门诊招募并签署书面知情同意书。根据关于MPS诊断标准的国际共识，本研究中MPS患者纳入标准如下:(A)斜方肌中存在紧绷肌带或结节;(B)按压硬结引起疼痛或牵涉痛;(C)通过刺激MTrPs的硬结可再现受试者的疼痛;以及(D)疼痛至少持续1个月。排除标准为可能影响疼痛敏感性的疾病，如全身炎症性疾病、颈部外伤、神经性疼痛、代谢性疾病、恶性肿瘤等，或参与前1周内使用止痛药、活检失败等。
2.样本的采集:本研究使用一次性SuperCore微创切割活检针从MPS患者斜方肌结节中穿刺活检MTrPs肌肉样本。所有参与者由同一名在MPS领域拥有20多年临床经验的医疗人员进行操作。确定MTrPs位置后，用0.5％利多卡因溶液1.5ml皮下注射麻醉，以减轻皮肤穿刺点的疼痛。穿刺前，使用拇指和食指向上提起紧绷肌带或结节以防止气胸。将活检针刺入肌肉，当痛感被触发或发生局部抽搐反应时，针尖慢慢向前推进3mm(活检针针尖距离针体组织凹槽距离为3mm)，使包含有MTrPs的肌肉组织正对凹槽部位。扣动扳机进行活检。将组织立即在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻，并保存在-80℃。
3.文库制备与RNA测序:提取总RNA后，进行RNA质检。质检合格后，根据TruSeqTMRNA样品制备指南，合成文库。用Qubit(R)2.0荧光仪对纯化的文库进行定量，然后利用Agilent2100生物分析仪进行进一步验证，最后在IlluminaNovaSeq6000上测序。处理原始数据后，利用RPKM值衡量基因的表达量。
4.差异表达基因的识别:在得到基因或转录本的FPKM表达值后，对组间基因表达进行差异分析。差异mRNA和LncRNA的筛选标准均为:Pvalue＜0.05且FC2，即表达值变化倍数为上调2倍(FC≥2)或下调2倍(FC≤0.5)。
5.功能富集分析:基于GO和KEGG数据，对差异基因进行富集分析，找出差异基因相关的生物学功能和信号通路。以Pvalue＜0.05为阈值筛选差异表达的富集分析结果。
研究结果:
1.DEmRNAs结果显示，与对照组相比，MTrPs组织中有2662mRNAs的表达明显上调，4092mRNAs的表达明显下调。DELncRNAs结果显示，与对照组相比，MTrPs组织中有767个LncRNAs表达上调，2356个LncRNAs表达下调。
2.GO和KEGG分析结果显示，在DEmRNAsGO富集分析中，差异基因功能主要富集在代谢过程、炎症反应、生长因子反应、骨骼肌收缩、酪氨酸激酶活性调节等方面;KEGG信号通路分析中，差异基因富集结果主要聚焦在自噬、生长因子信号通路、炎症相关通路、血管平滑肌收缩、糖酵解/糖异生、细胞凋亡及代谢等方面。DELncRNAsGO富集分析中，靶基因功能主要富集在RasGTPase结合、ATP结合、激酶磷酸酶活性、糖酵解及各类物质代谢过程、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路等;KEGG通路分析显示，差异基因主要富集于炎症相关信号通路、脂类及氨基酸等代谢过程、Jak-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路、趋化因子信号通路、血管平滑肌收缩等。
研究结论:
1.MTrPs组织中，mRNA与LncRNA表达谱发生显著改变。
2.生物信息学分析发现:多种信号通路和功能因子可能参与了MTrPs的病理生理过程。
第二部分酪氨酸激酶在肌筋膜扳机点的表达和机制初探
研究目的:
1.检测MPS患者斜方肌MTrPs部位肌肉组织与对照组肌肉组织形态学差异。
2.利用磷酸化蛋白芯片检测MTrPs与对照组肌肉组织中酪氨酸激酶(TKs)家族蛋白的磷酸化表达差异，并进一步验证差异表达蛋白，探究其在MTrPs中的功能。
研究方法:
1.HE染色与Masson染色:将穿刺组织经过固定、包埋制作蜡块，然后制成石蜡切片。再通过脱蜡、水化、染色、封片等过程，进行HE染色与Masson染色，观察两组组织形态学差异。
2.RayBiotech芯片检测:样本提取总蛋白后，使用了RayBiotech人磷酸化蛋白检测试剂盒(AAH-PRTK-G1)进行芯片检测，蛋白含量的检测根据试剂盒的说明进行。首先，将封闭缓冲液100μl加至每个孔中，并在室温下轻轻摇动孵育30分钟，然后倒出每个孔的封闭缓冲液。在确保所有缓冲液去除后，各孔中加入各个样品100μl，4℃孵育过夜。第二天室温下复温30min，加入洗涤缓冲液洗涤。抽去洗液后，将100μl1x生物素偶联的抗磷酸酪氨酸抗体加入每个相应的孔中，并在室温下轻轻摇动孵育2h。加入洗涤缓冲液洗涤后，将100μl结合荧光染料的链霉亲和素添加至孔中，洗涤3次并完全干燥，使用激光扫描仪检测。
3.Westernblot验证差异蛋白表达:提取总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，通过电转印将蛋白转印至PVDF膜。室温下封闭90min、一抗4℃孵育过夜、二抗室温孵育90min后，进行化学显影。
4.免疫组织化学染色进一步验证差异蛋白表达及定位:石蜡切片经过脱蜡水化、抗原修复后，进行封闭、孵育一抗和二抗、DAB显色和苏木素复染等步骤，封片后显微镜下观察差异蛋白表达及定位。
研究结果:
1.显微镜下观察发现，对照组肌纤维大小均匀，呈多边形，横截面和纵向空间排列规则。MTrPs中的肌纤维在横断面上显示大小不等的圆形或椭圆形，纵切面可见锥型肌纤维，横切面和纵切面的肌纤维间距均增加。另外，MTrPs部位异常收缩肌纤维未见伴有明显炎症细胞浸润与纤维化现象。
2.蛋白芯片检测MTrPs和对照组织的TKs蛋白磷酸化的表达发现，在71个TKs中，与对照组相比，有15个蛋白磷酸化水平在MTrPs组织中表达升高(P＜0.05)，2个蛋白磷酸化水平表达降低(P＜0.05)。EphB家族中p-EphB1(P＜0.05)、p-EphB2(P＜0.05)、和p-EphB3(P＜0.001)在MTrPs组织中的表达明显高于对照组。
3.Westernblot实验证实，与对照组相比，MTrPs组织中p-EphB的表达明显增加(P＜0.05)。免疫组织化学分析显示p-EphB在MTrPs异常收缩肌纤维的细胞膜上表达增加。
4.相关性分析发现，MPS患者MTrPs组织中p-EphB1(r=0.723，n=11，P＜0.05)、p-EphB2(r=0.610,n=11,P＜0.05)、p-EphB3(r=0.670,n=11，P＜0.05)、p-PDGFRa(r=0.711,n=11,P＜0.05)和p-TRKB(r=0.640,n=11,P＜0.05)的表达水平与MPS患者斜方肌MTrPs的疼痛数字评分量表(NRS)评分显著相关。
研究结论:
1.在MPS患者斜方肌MTrPs区域发现异常收缩的肌纤维，这与前期MTrPs研究假说一致。
2.蛋白芯片检测MTrPs和对照组织的TKs家族蛋白磷酸化的表达发现，两组间存在多个差异表达蛋白。其中p-EphB在MTrPs的异常收缩肌纤维中表达升高，并且与疼痛数字评分显著相关。EphB可能参与MTrPs的病理生理过程，需要进行更深一步探究。
第三部分关于EphrinB1/EphB1信号通路参与介导MTrPs疼痛的研究
研究目的:
1.SD大鼠腓肠肌内梯度注射EphB1配体激动剂EphinB1-Fc，分析EphrinB1/EphB1信号通路在肌痛外周敏化中的作用。
2.构建MTrPs动物模型，探索EphrinB1/EphB1信号在MTrPs中的表达及其作用机制。
研究方法:
1.实验动物:动物实验经过山东大学实验动物伦理委员会批准。研究选用6周龄雄性SD大鼠，体重约200-250g，实验大鼠在室温24℃，相对湿度20％-30％，光照12小时/暗12小时的条件下饲养。每个笼子中有三只动物，这些动物可以自由获得食物和水。
2.局部注射:在短暂异氟醚麻醉下，将不同浓度的EphrinB1-Fr(0.02，0.2，2μg/μl，30μl，i.m，n=4)注入大鼠左侧腓肠肌，以相同体积的PBS作为对照，观察大鼠腓肠肌注射EphrinB1-Fc的直接致痛效应。为进一步研究EphrinB1是否通过其受体EphB1发挥作用。左侧腓肠肌注射EphrinB1-Fc(2μg/μl，30μl，i.m，n=6)前，在同一部位注射EphB1抑制剂EphB1-Fr(2μg/μl，30μl，i.m，n=6)，而对照组仅给予等量的PBS。所有大鼠均于注药前0.5h、注药后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h测定左腿腓肠肌压痛阈值。
3.构建MTrPs动物模型:选用6周龄雄性SD大鼠。环境适应一周后，对SD大鼠左侧腓肠肌采用每周一次钝挫击打联合跑台离心训练的方式干预8周，然后进行4周恢复，建立大鼠MTrPs模型。即每周用自制的动能为2.352J的棒状装置击打标记好的左侧腓肠肌，第二天将大鼠放入无菌跑步机上，向下角度为-16°，速度为16m/min，持续1.5h。观察大鼠肢体运动、结节变化和压痛阈值改变。根据以下标准确定MTrPs造模成功:1)触诊发现局部有肌紧张带或结节;2)结节上的压痛阈值明显降低;3)通过针刺可以诱发局部抽搐反应。
4.药理学实验:验证大鼠MTrPs造模成功后，将大鼠随机分为三组(n=6):MTrPs+PBS组，MTrPs+EphB-Fr组和Control+PBS组。MTrPs+EphB-Fr组在大鼠左腿腓肠肌MTrPs注射EphB抑制剂EphB-Fr(2ug/ul，30μl×3点)，同时MTrPs+PBS组和Control+PBS组注射与抑制剂体积相同PBS为对照，在肌肉注射后0.5h、1h、2h、4h、8h和24h，用电子压痛仪测量结节部位压痛阈值。
5.Western检测蛋白表达:收集组织并提取总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后通过电转印将蛋白转印至PVDF膜。室温下封闭90min、一抗4℃孵育过夜、二抗室温孵育90min后，进行化学显影。检测p-EphB及其相关蛋白的表达。
研究结果:
1.肌肉梯度注射EphB1配体激动剂EphrinB1-Fc产生了时间依赖性和剂量依赖性痛觉过敏，同时脊髓背角c-Fos蛋白表达增加。注射30min后，压痛阈值开始呈剂量依赖性降低，疼痛反应持续至少4h。注射24小时后，伤害性阈值恢复到基线水平。EphB1-Fc预处理可部分阻止EphrinB1-Fc引起的压痛阈值降低。
2.MTrPs大鼠模型结节、压痛阈值、和形态学变化:造模组大鼠于造模开始2周后，在腓肠肌中部触诊发现紧绷结节。第3周开始，结节部位压痛阈值与对照组相比出现降低，这种差异持续了12周(P＜0.05)。与此同时，对照组结节触诊及压痛阈值并没有发生变化(P＞0.05)。HE染色后，显微镜下观察发现对照组大鼠肌肉组织横切面可见肌纤维大小均匀，呈现规则的多边形，横断间隙排列规则整齐。而MTrPs横切面可见大而圆的肌细胞，也可见明显的炎性细胞浸润。
3.与对照组相比，MTrPs造模组大鼠中的p-EphB表达明显升高(P＜0.05)。肌肉注射EphB1-Fr可使MTrPs造模组大鼠的压痛阈值部分恢复，这种恢复持续了近4小时。而MTrPs+PBS组大鼠及Control+PBS组大鼠注射PBS后对压痛阈值未产生明显影响。Westernblot实验检测发现，MTrPs+EphB-Fr组给予Eph-Fr(2.5 mg/ml)后不仅抑制p-EphB的表达，同时p-NR2B的表达也降低。
研究结论:
EphrinB1可以通过其高亲和力受体EphB1诱导肌肉痛觉过敏。同时EphB1在与MTrPs相关的外周伤害性信息的调制中发挥重要作用，可能是MPS治疗的重要靶点之一。