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本试验对采集于华南农业大学野生稻核心收集圃的野生稻—高杆野生稻进行分离,采用无氮培养基,结合乙炔还原法测定固氮酶活性,经平板划线法共分离筛选到43株内生固氮菌,并利用全细胞蛋白电泳、插入序列指纹图谱对其进行聚类分析,选取部分代表菌株进行16S rDNA序列测定。选取部分固氮活性较高的内生固氮菌,对其进行特性研究,包括不同pH、渗透压、铵离子、培养时间、培养温度等环境因子对这些菌株固氮酶活性的影响,得出以下结果:
以高杆野生稻的根、茎、叶为材料,结合乙炔还原法测定固氮酶活性,通过PCR扩增固氮酶nifH基因,分离得到43株内生固氮菌,茎部24株;根部11株;叶部8株。各菌株固氮酶活性差异较大,分布在1.23nmol C2H2 mL-1h—1(菌株ZF11)至506.46nmol C2H2 mL-1h—1(菌株ZF10)之间。
采用IS-PCR和SDS-PAGE全细胞蛋白电泳聚类方法将43株内生固氮菌分为6个类群。各个类群在蛋白电泳和IS-PCR指纹图谱上差异较小,有较好的一致性。由16S rDNA测序结果和系统发育分析得知,其中类群Ⅰ和Ⅱ的菌株属于克雷伯氏属不同种群;类群Ⅲ的ZF13与Burkholderia cepacia的相似性为98%;类群Ⅳ和类群Ⅵ的菌株代表肠杆菌属的不同种群;类群Ⅴ的菌株属于假单胞菌属。
选取了6株代表菌株,测定其在不同环境条件下固氮酶活性,研究其对环境的适应性。结果表明,各供试菌株最适培养温度范围在30℃~35℃;最适培养时间为24—48小时;最适固氮pH为6~7;各菌株均具有一定的耐渗透压能力,各菌株在1.5%以下的盐分(NaCl)浓度仍能表现出固氮酶活性;6株供试菌株均可以在NH4+浓度为0mM~1.0mM下固氮。菌株对环境的适应能力较强。