论文部分内容阅读
目的:探讨以粉尘螨Der f 1的T细胞表位融合肽为疫苗对过敏性哮喘小鼠进行特异性免疫治疗的效果和对STAT4/STAT6信号通路的影响。方法:将Derf 1的8段T细胞表位,按照T1-T2-T3-T4-T5-T6-T7-T8连接方式合成融合肽,命名为Derf IT。将上述融合基因克隆到pET28a(+)中,构建pET28a(+)-Der f 1 T重组载体,用限制性内切酶验证,将pET28a(+)-Der f 1 T重组载体转入E. coli BL21(DE3)中,用不同浓度的IPTG小剂量诱导表达Der f 1 T,确定出最适浓度,然后在最适IPTG浓度条件下进行Derf IT的大剂量表达并纯化。制样进行SDS-PAGE、Western bloting鉴定分析表达的蛋白。以粉尘螨粗提液为致敏原,构建小鼠过敏性哮喘模型,30只小鼠按每组10只随机分为三组,PBS组、哮喘组和免疫治疗组。以纯化的Der f 1 T细胞表位融合肽为疫苗对哮喘小鼠模型进行特异性免疫治疗。处死小鼠,分别收集每组小鼠的标本。应用ELISA法检测脾细胞培养上清和BALF中细胞因子IL-13和IFN-y含量及血清中特异性IgE (slgE)和IgG2a水平。提取各组肺组织蛋白行Western bloting鉴定STAT4/STAT6蛋白的表达情况。结果:双酶切和测序结果说明原核表达载体pET28a(+)-Der flT构建成功;SDS-PAGE说明Der flT诱导且纯化成功;Western bloting进一步说明Der flT蛋白纯化成功;肺组织病理切片镜检说明,免疫治疗组小鼠炎症反应比哮喘组炎症明显好转,炎症细胞浸润减轻。小鼠BALF中嗜酸性粒细胞数结果为免疫治疗组嗜酸性粒细胞数明显低于哮喘组(p<0.01)。免疫治疗组小鼠的BALF中细胞因子IL-13含量与哮喘组小鼠相比显著降低(p<0.01),IFN-γ含量的变化与之截然不同,免疫治疗组明显高于哮喘组(p<0.01)。各组脾细胞培养上清中IL-13,免疫治疗组明显低于哮喘组(p<0.01),IFN-γ含量的变化与之截然不同,免疫治疗组比哮喘组显著升高(p<0.01)。血清中特异性IgE含量结果为免疫治疗组明显低于哮喘组(p<0.01),IgG2a变化水平与IgE变化正好相反,免疫治疗组比哮喘组显著升高(p<0.01)。结论:成功表达Derf 1的T细胞表位重组蛋白,且该蛋白有效缓解哮喘小鼠的炎症反应并纠正Th1/Th2失衡。