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目的本文以菠萝生产废料-菠萝皮为原料,提取、分离和纯化其中的菠萝蛋白酶,并分别从贮存条件和物理、化学因素三个方面对菠萝皮蛋白酶的稳定性进行了分析,通过测定米氏常数、半衰期和活化能这三个参数探讨菠萝皮蛋白酶的热稳定效果,并将菠萝皮蛋白酶初步应用于鱼鳞蛋白的酶解,优化了酶解鱼鳞的水解条件,同时对菠萝皮蛋白酶酶解鱼鳞蛋白的米氏常数进行分析,不但节约资源,增加经济效益和环境效益,还为开发新的蛋白酶源并将其应用于实际提供了科学依据和实验基础。方法采用单因素实验的方法,选择液料比(v:m)、提取p H和提取温度(℃)三个主要影响因素为考察对象,以蛋白酶含量(mg/g)为评价指标进行响应面分析,优化菠萝皮蛋白酶提取的工艺参数;通过硫酸铵盐析沉淀、透析除盐和羧甲基纤维素(Carboxymethyl Cellulose,CMC)柱层析法对菠萝皮蛋白酶进行分离提纯,以获得纯度和酶活力相对较高的酶液,即为纯化酶;对纯化酶进行紫外光谱扫描,初步鉴定酶的纯化度,再通过高效液相色谱仪对纯化酶进行进一步的定性和定量分析;最后计算提取、分离和纯化各阶段的蛋白酶液的含量、酶活力、比活力、纯化倍数和酶活回收率。以纯化酶为研究对象,通过单因素实验方法研究不同贮存条件、物理和化学因素对菠萝皮蛋白酶酶活性的影响,初步获得菠萝皮蛋白酶的稳定性条件。为探讨菠萝皮纯化酶的热失活性质,通过绘制双倒数曲线获得以酪蛋白为底物的米氏常数,通过绘制热失活速率曲线获得菠萝皮蛋白酶的反应速度常数K,由不同的K值求得不同温度(T)下的半衰期(t1/2),再以lnk对1/T作图,根据Arrhenius方程获得酶反应的活化能?E。初步应用菠萝皮蛋白酶酶解鱼鳞蛋白,以水解度作为评价指标,在单因素实验基础上,通过响应法优化底物浓度[S](%)、酶解温度(℃)、酶解时间(min)和酶用量[E/S]四个主要因素对酶解鱼鳞蛋白的影响,以获得酶解鱼鳞蛋白的最优参数,并对菠萝皮蛋白酶酶解鱼鳞蛋白的米氏常数做初步分析。结果1、运用响应面分析法优化菠萝皮粗蛋白酶的提取的最优工艺参数为:提取温度50℃、提取时间50min、料液比3:1和提取p H6.0,通过最佳工艺条件获得菠萝皮粗蛋白酶的含量最高为0.937±0.012mg/g,最优条件下的酶活为1.823U/m L。2、采用硫酸铵盐析法纯化菠萝皮蛋白酶获得最佳盐析百分比为30%;透析和CMC层析法纯化菠萝皮蛋白酶后的纯度为90.08%,浓度为223.62μg/m L。3、菠萝皮蛋白酶最佳贮存条件为低温避光贮存、水分含量小于20%、贮存时间小于4h的条件下稳定性最好。4、物理因素对菠萝皮蛋白酶稳定性的研究结果表明,温度小于25℃、p H在3.0~6.0之间时酶的稳定性较好;5、化学因素对菠萝皮蛋白酶稳定性的研究结果表明,Ca2+、EDTA、葡萄糖、D-木糖、麦芽糖、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、亚硝酸钠和柠檬酸对菠萝皮蛋白酶都有较强的激活作用;硫代硫酸钠、Na+、K+、蔗糖和淀粉对菠萝皮蛋白酶活性影响不明显;Fe3+、Al3+、甲醇、乙醇和正丁醇对菠萝皮蛋白酶具有显著的抑制作用。6、菠萝皮蛋白酶的热动力学研究结果表明,菠萝皮蛋白酶的米氏常数Km为5.122g/L,在45、55、65和75℃四种贮存条件下,菠萝皮蛋白酶半衰期t(1/2)分别逐渐下降,由Arrhenius方程求的反应的活化能?E为2.6×103J/mol。7、通过单因素实验及响应面分析法获得菠萝皮蛋白酶酶解鱼鳞蛋白的最佳酶解条件为底物浓度[S]5%、酶解温度70℃、酶解时间2.5h、加酶量[E/S]9%,最佳条件下的水解度为1.314±0.040%;菠萝皮蛋白酶酶解鱼鳞蛋白的米氏常数为4.11%。结论研究结果表明,菠萝皮中蛋白酶含量较高,具有较高的活性,最佳工艺条件下的酶含量为0.937±0.012mg/g,酶活为1.823U/m L;经过分离纯化后此酶活性显著提高,经鉴定纯化效果较好,纯度为90.08%,纯化倍数为10.26倍;稳定性结果表明,低温避光贮存、水分含量小于20%、贮存时间小于4h、p H在3.0~6.0之间的条件下稳定性较好,Ca2+、EDTA、葡萄糖、D-木糖、麦芽糖、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、亚硝酸钠和柠檬酸对此酶有较强的激活作用;Fe3+、Al3+、甲醇、乙醇和正丁醇对此酶有显著的抑制作用;动力学研究结果表明,菠萝皮蛋白酶的米氏常数Km为5.122g/L,活化能?E为2.6×103J/mol;将菠萝皮蛋白酶应用于鱼鳞蛋白的酶解具有一定的可行性,水解度为1.314±0.040%,米氏常数为4.11%。