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某些微生物在环境渗透压胁迫下合成渗透压补偿溶质,Ectoine(四氢嘧啶,1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸,1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimdine carboxylicacid)是细菌中分布最广泛的渗透压补偿溶质之一。Ectoine在脱水、辐射、冷冻等逆环境下非特异性的保护细胞、蛋白质、核酸等生物及生物大分子活力的特性。目前Ectoine已经用于护肤品中的保湿剂,在许多商业中,比如酶的稳定剂、微生物的保护剂、化疗中健康细胞的保护剂等,也都在研发中。目前Ectoine由细菌发酵制备,因为Ectoine是胞内物质,受胞内浓度阈值限制,产量低,成本高,是工业化生产的技术瓶颈。
为了提高Ectoine的制备效率,本文拟采用基因工程技术异源表达Cobetiamarina的Ectoine合成酶基因ectABC,并考察表达条件对Ectoine表达量的影响。采用步移PCR方法扩增C.marina的ectABC；构建ectABC表达载体PpET／ect和pET／ect,转化至大肠杆菌E.coli BL21中,通过抗生素抗性筛选、ectABC基因PCR鉴定、Ectoine合成表型鉴定,获得ectABC重组子；考察重组方式和重组子诱导表达条件对Ectoine表达量的影响。
C.marina的Ectoine合成酶基因ectABC由558 bp、1263 bp和393 bp组成的三个开放阅读框架组成,它们共用一个启动子Pect。C.marina的ectABC基因和表达载体pET43.1a通过限制性内切酶BamHⅠ／SalⅠ切割并用T4 DNA片段连接试剂盒连接,分别获得了携有和没有Pect的重组表达载体PpET／ect和pET／ect。重组表达载体PpET／ect和pET／ect分别转化至E.coli BL21中,获得了ectABC重组子PpET／ect／BL06和pET／ect／BL22。考察重组子PpET／ect／BL06和pET／ect／BL22诱导表达条件对Ectoine合成的影响,实验结果表明,C.marina ectABC转化E.coliBL21,在特定的诱导条件下能够表达Ectoine。NaCl浓度为1％时,当培养基中存在其它渗透压补偿溶质时,重组子PpET／ect／BL06和pET／ect／BL22能够生长,但是自身不合成Ectoine；不加IPTG、Lac启动子不工作,NaCl作为诱导物诱导表达时,ectABC基因的上游启动子Pect启动Ectoine诱导表达,但是表达量较Lac启动子与Pect启动子协同作用的表达量低；NaCl浓度在1％-6％的范围内时,重组子PpET／ect／BL06的Ectoine合成量随NaCl浓度升高而提高。