论文部分内容阅读
目的： 现代药理学分子机制研究发现:Harmaline和Harmine能够抑制单胺氧化酶(MAO)和抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)等而发挥中枢神经系统的药理作用，骆驼蓬碱(Harmaline)和去氢骆驼蓬碱（Harmine）是蒺藜科(Zygophyllaceae)骆驼蓬属（Peganum）植物的主要成分，属于骆驼蓬生物碱中的β-咔啉类生物碱。 由内皮细胞构成的血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)被认为是血-中枢神经系统物质交换和内环境平衡的主要屏障。BBB的存在严格限制了血液与脑组织之间离子和物质的交换，在中枢神经系统外围构筑了一道防线，在保护脑免受外界化学物质伤害的同时，也将神经药物等有利物质阻隔在大脑之外。 本论文对骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱的跨血脑屏障性质及脑内过程进行全面考察，梳理给药后脑内相关神经递质的变化，分析脑内生物碱浓度和神经递质变化的相关性。从分子水平、细胞水平评价骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱对MAO-A、AChE酶活性、mRNA和蛋白表达的抑制作用。 方法： (1)骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱透血脑屏障的体外评价:采用大鼠脑血管内皮细胞(RBE4)与胶质细胞(C6)共培养的方式建立BBB体外渗透性评价模型，评价化合物HAR和HAL透过BBB的难易程度。同时考察测试药物浓度、暴露时间、温度及P-gp转运体抑制剂对HAL、HAR累积转运量和表观渗透系数的影响。 (2)骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱透血脑屏障的体内评价:建立UPLC-ESI-MS/MS测定骆驼蓬生物碱的方法，尾静脉注射骆驼蓬生物碱后，通过微透析法收集0-300min之间12个时间点的透析样品，分析各时间点采集的脑透析液和颈静脉透析液样品，考察HAL、HAR在大鼠体内透过血脑屏障的程度及骆驼蓬生物碱在血液、纹状体中的药动学行为。 (3)骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱对大鼠中枢神经系统递质的影响:建立UPLC-ESI-MS/MS测定22种神经递质的方法。尾静脉注射骆驼蓬生物碱后，通过微透析法收集0-300min之间12个时间点的透析样品，分析各时间点采集的脑透析液和颈静脉透析液样品，检测大鼠给药前后骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱对大鼠纹状体中22种神经递质与其代谢产物的影响。 (4)骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱对MAO和AChE的选择性抑制作用:利用特异性探针建立人肝非微粒体酶孵育的方法，考察46种骆驼蓬生物碱对MAO-A的抑制作用，对其IC50值、抑制类型和构效关系进行分析。进而建立Cocktail的方法考察骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬对MAO-A、AChE的选择性抑制作用。 (5)分子对接模拟:根据对接的GBVI/WSA dG打分得到最终优势构象库，进一步分析酶分子和化合物间的二维和三维作用力，评价骆驼蓬生物碱与酶分子间的亲和力及抑制活性。 (6)骆驼蓬碱对细胞MAO-A、AChE mRNA和蛋白表达的影响:利用RBE4细胞与骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱共培养的方法，收集0.5，1，2，4，6，12h细胞裂解液，利用real-time PCR和western blotting方法考察骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱对MAO-A、AChE的基因和蛋白表达的抑制作用。 结果： (1)骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱透血脑屏障的体外评价:HAR和HAL的累积通透量随着孵育时间和药物浓度的增加而增加。4℃时HAR的表观渗透系数为2.84±0.38×10-3cm/min，是37℃时HAR表观渗透系数2.25±0.15×10-3cm/min的1.26倍，推测HAR的渗透转运可能有转运体的参与。当在转运的过程中加入P-gp的特异性抑制剂维拉帕米后，HAR从AP侧转运到BA侧的表观渗透系数变为3.23±0.31×10-3cm/min，表观渗透系数增大1.58倍;从BA侧转运到AP侧的表观渗透系数为3.23±0.12×10-3cm/min，表观渗透系数减小1.1倍。加入P-gp特异性抑制剂维拉帕米，HAL的表观渗透系数Papp AP→BA与Papp BA→Ap均未发生显著变化。综上所述，实验结果显示HAR、HAL均可透过血脑屏障，且HAR的跨血脑屏障转运有主动转运体P-gp的参与。 (2)骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱透血脑屏障的体内评价:纹状体中HAL的动力学参数Cmax=10.85±2.72ng·ml-1，AUC(0-t)=5096.02±2133.75ng·min·ml-1;血液中HAL的动力学参数Cmax=164.26±131.94ng·ml-1，AUC(0-t)=172361.20±318001.91ng·min·ml-1。血液中HAL浓度和脑纹状体中HAL浓度呈现极大的相关性(r=0.667，p=0.037)，HAL血药浓度与HAL脑药浓度之比平均值为10.47±7.39。透析过程中在血液和纹状体中均可检测到HAL的代谢产物HAR，脑纹状体中HAR的药动学参数为Cmax=4.47±1.86ng·ml-1，AUC(0-t)=1412.73±100.25ng·min·ml-1;血液中HAR的药动学参数为Cmax=18.81±9.18ng·ml-1，AUC(0-t)=3655.91±770.73ng·min·ml-1。尾静脉注射HAR(1mg/kg)后，血液和脑纹状体的30-300min微透析样品中均可检测到HAR。采用非房室模型法计算药代动力学参数，结果显示:纹状体中HAR的动力学参数Cmax=21.16±10.76ng·ml-1，AUC(0-t)=4690.72±3061.78ng·min·ml-1，血液中HAL的动力学参数Cmax=240.62±107.35ng·ml-1，AUC(0-t)=166068.37±252207.55ng·min·ml-1。血液中HAR浓度和脑纹状体中HAR浓度呈现较大的相关性(r=0.658，p=0.039)，血药浓度与脑药浓度之比为10.73±4.02。 (3)微透析技术测定骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱对中枢神经系统递质的影响:大鼠尾静脉注射HAL(1 mg/kg)后，0-300min纹状体神经递质中CH、GABA、Glu和Phe的浓度变化呈现一种递减的趋势，平均变化速率分别为VCH=1.41ng/ml/min、VGABA=0.73ng/ml/min、VGlu=3.86ng/ml/min和VPhe=1.10ng/ml/min。0-300min血液中神经递质的变化VTrp=1.16ng/ml/min、V5-HT=0.22ng/ml/min，VCH=1.97ng/ml/min、VGABA=0.14ng/ml/min、VGlu=7.18ng/ml/min。大鼠尾静脉注射HAR(1mg/kg)后，0-300min纹状体神经递质中CH和GABA的浓度变化呈现一种递减的趋势，平均变化速率分别为VCH=1.16ng/ml/min、 VGABA=0.22ng/ml/min。Tyr在210分钟内显示先降低后升高的趋势，VTyr(0-210 min)=0.11ng/ml/min，VTyr(210-300min)=0.11ng/ml/min。血液神经递质的平均变化速率为VTrp=5.86ng/ml/min，V5-HT=0.19ng/ml/min, VCH=1.93ng/ml/min,VGABA=0.11ng/ml/min和VGlu=9.38ng/ml/min。 (4)骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱对MAO和AChE的选择性抑制作用:HAL和HAR对MAO-A酶蛋白的抑制活性高于对AChE的抑制活性，HAL对MAO-A比对AChE的选择性抑制能力强97.5倍，HAR对MAO-A比对AChE的选择性抑制能力强2.5倍。混合探针法进一步显示骆驼蓬生物碱对MAO-A比对AChE的抑制作用强。 (5)分子对接模拟:分子模拟结果显示HAR、HAL对接到MAO-A受体的GBVI/WAS dG分数低于对接到AChE受体的GBVI/WAS dG分数，说明HAR、HAL与MAO-A酶蛋白的亲和性较高一些，即抑制活性高一些。 (6)骆驼蓬碱对细胞MAO-A、AchE的mRNA和蛋白表达的影响:骆驼蓬生物碱对RBE4细胞的AChE的mRNA表达、蛋白表达抑制作用较强。0.5 h时给药组RBE4细胞中mRNA的表达量为空白组的10％，抑制率达到90％。 结论： 大鼠微透析实验结果表明HAL、HAR是较易透过血脑屏障的化合物，是值得进一步深入研究的神经系统潜在药物。RBE4细胞BBB模型也证实这一结果并且发现HAR为P-gp的底物。尾静脉注射给予HAL后，SD大鼠脑纹状体内CH、GABA、Glu和Phe的浓度产生呈现一种递减的趋势;尾静脉注射HAR后，大鼠纹状体中的CH和GABA的浓度呈现一种递减的趋势，Tyr的含量呈现先降低后升高的趋势。HAR与HAL均对大鼠脑内纹状体中乙酰胆碱能神经递质的影响较大，研究结果提示HAR、HAL具有潜在的抗阿尔茨海默病的作用，具有极大的开发和利用价值。Cocktail法结果显示HAR、HAL对MAO的选择性抑制作用强于AchE，分子对接从亲和力的角度进一步证明了这一结论。Real-time PCR与Western blotting实验结果显示RBE4细胞中AChE的mRNA、蛋白表达受到HAR、HAL的显著抑制，表明了HAR、HAL对胆碱能神经递质的影响，不仅是对AchE的酶活性产生抑制而且从分子水平调节AchE的蛋白表达量。