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叶酸(Folic acid,FA)是机体一碳代谢循环中重要的甲基供体,在DNA合成、稳定性及修复中起关键作用。FA缺乏会导致DNA碱基错配、缺失、DNA链和染色体断裂等基因组不稳定性(Genomic instability,GIN)的发生。纺锤体组装检查点(Spindle assembly checkpoint,SAC)作为细胞有丝分裂中期与后期之间存在的一种安全监督机制,作用是确保染色体精确分配到子代细胞,防止非整倍体细胞的产生。精子的质量和密度对男性生殖至关重要,不育患者的精子质量差、密度低,并且精子非整倍体数目明显增加,非整倍体会促进GIN的发生。FA缺乏是否对SAC产生影响,SAC在叶酸缺乏导致基因组不稳定性中扮演者什么角色少有报道。本文旨在探讨FA缺乏对小鼠精原细胞(GC-1spg)基因组稳定性和SAC相关蛋白基因表达的影响,初步探讨FA缺乏对生殖细胞基因组稳定性影响的机制。采用CCK-8、胞质分裂阻断微核细胞组分析(cytokinesis-block micronucleus cytome assay,CBMN-cyt)、流式细胞术、荧光定量PCR、Western bolt等实验技术;叶酸浓度为2000 nmol/L作为正常对照组,比较分析了FA浓度为200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L时,对小鼠精原细胞基因组稳定性及对FA缺乏敏感性的影响,研究了不同浓度FA对SAC相关蛋白基因表达量的影响,探讨了FA缺乏诱发生殖细胞基因组不稳定性的潜在机制。研究结果显示:(1)GC-1spg细胞连续培养两周后细胞形态改变、生长速度明显降低,提示两周连续培养即可达到实验所需缺乏模型;(2)FA浓度为200 nmol/L时对细胞增殖产生明显抑制(P<0.01),且FA浓度越低增殖抑制越明显,说明FA对细胞增殖的抑制具有浓度依赖性;(3)200 nmol/L组小鼠精原细胞主要遗传损伤标志(MN,微核;NPB,核质桥;NBud,核芽)高于正常对照组(P<0.05),20 nmol/L组和0 nmol/L组与正常对照组相比遗传损伤显著增加(P<0.01),且以染色体断裂有关标志微核(micronucleus,MN)和DNA异常扩增标志核芽(Nucleus buds,NBud)为主(P<0.05),因此,FA为200 nmol/L时已经不能维护细胞基因组稳定性;(4)FA浓度为200 nmol/L时,发现其凋亡率与正常对照组无显著差异,FA浓度为20 nmol/L和0 nmol/L时,细胞出现凋亡(P<0.05),且0 nmol/L组细胞凋亡更加明显(P<0.01),提示FA浓度低于200 nmol/L时会诱导细胞发生凋亡;(5)荧光定量PCR结果显示:随着FA浓度的降低,GC-1spg细胞中Mad 1、Mad2、Bub1、Bub 3、BubR1、CDC20、c-myc mRNA的表达量水平升高(P<0.05),且浓度越低表达量越高,Western bolt实验结果显示Mad2、Bub1、BubR1的蛋白表达量显著增高(P<0.01),Bub3 mRNA和蛋白质表达量均无统计学差异,结果证实FA缺乏时并非所有的SAC蛋白基因都会高表达,而高表达的蛋白基因具有浓度依赖性,且FA缺乏可能通过c-myc途径对SAC进行调节;(6)甲基化预测以及5—氮胞苷(5-AZA)实验结果提示SAC可能受甲基化调控。本研究探讨了不同浓度FA对GC-1spg细胞GIN和SAC相关蛋白基因表达的影响,证实了:在FA浓度为200 nmol/L情况下会诱导GC-1spg细胞发生遗传损伤,该条件下会抑制细胞增殖,细胞未发生凋亡,FA浓度低于200 nmol/L时GC-1spg细胞遗传损伤加重会抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,提示FA浓度为200nmol/L GC-1spg细胞已经达到缺乏状态。研究证实了FA缺乏会引起SAC基因和c-myc mRNA以及SAC蛋白高表达,并且具有浓度依赖性,结合甲基化预测结果,提示FA缺乏时SAC可能受c-myc通路或者甲基化调控。