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木聚糖是一种非均相聚合物,是半纤维素的主要成分之一。在过去的几十年里,作为生物质降解酶系中主要成员的木聚糖酶成为研究的热点,其在纺织品、食品、饲料、造纸以及医药等多个工业领域中都得到了广泛的应用。木聚糖酶主要作用于木聚糖的β-1,4-糖苷键,水解产生不同分子量的低聚木糖和木糖。目前,国内外已报道的克隆表达的木聚糖酶基因中大多数在高温下的热稳定性都比较差,不能满足工业生产需求,这也使木聚糖酶的应用受到了极大的限制。因此,对木聚糖酶的热稳定性的研究具有十分重要的意义。木聚糖酶Umxyn10A(Gen Bank序列号ABL73-883.1)是由本实验室前期从堆肥未培养微生物中筛选得到,属于GH 10家族。将木聚糖酶基因Umxyn10A去掉跨膜结构域的编码序列并进行密码子优化后,将其在大肠杆菌中进行表达,结果发现,木聚糖酶Umxyn10A最适反应温度为80℃,但热稳定性较差,当温度超过60℃时酶活力大幅度下降,其在65℃下的半衰期为15 min,在75℃下保温4 min就几乎失活。木聚糖酶 Umxyn 10A的最适pH为6.0,在pH 4.5～10.0范围能保持80%以上的酶活。该酶除了对木聚糖有较强的水解能力外,对其它底物羧甲基纤维素钠(CMC)、微晶纤维素(Avicel)、淀粉(Starch)、几丁质(Chitin)、地衣多糖(Lichenan)、2-羟乙基纤维素(2-Hydroxyethyl cellulose)和甲基纤维素(Methylcellulose)均没有酶活力。CuCl2、AL2(SO4)3、AgNO3和十二烷基硫酸钠(SDS)对木聚糖酶Umxyn1OA的酶活力都有很强的抑制作用,其它金属离子对其酶活力影响不大。木聚糖酶Umxyn1OA对木寡糖的水解产物主要以木二糖为主,其具有潜在的商业应用价值。以不同浓度的木聚糖为底物,测得其Km和Vmax值分别为3.14 mg/mL和为370.37μmol/(min·mg)。结果表明,重组酶Umxyn1OA具有优良的酶学特性,但热稳定性较差,因此利用定点突变技术对该酶进行突变,以期提高其热稳定性。将木聚糖酶Umxyn1OA与已报道的GH10家族的4种耐热木聚糖酶的氨基酸序列进行多重序列对比以及三维结构的同源建模分析,选定10个氨基酸位点进行定点突变。分别构建该酶的10个突变基因的重组表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达以及蛋白纯化。测定突变后的10个重组酶的酶学性质,最终得到两个热稳定性显著提高的突变酶Umxyn10AA31F和Umxyn1OAL307V。突变酶Umxyn10AA31F最适反应温度为85℃,比野生酶提高了5℃,其在65℃和70℃下的半衰期分别为105min和15min,与野生酶相比分别提高了 6倍和2倍。突变酶Umxyn10AL307V的最适反应温度为80℃,与野生酶保持一致,在65℃的半衰期为40min,与野生酶相比提高了 1.5倍。而且,突变酶Umxyn10AA31F和Umxyn10AL307V在热稳定性提高的同时,其pH耐受性、金属离子对酶活力的影响以及水解产物等都保留了野生酶优良性质。为了使木聚糖酶Umxyn1OA的热稳定性得到进一步的提高,将该酶的31位点氨基酸和307位点氨基酸进行双点突变,并在大肠杆菌中进行表达和蛋白纯化。结果发现,突变酶Umxyn1OAA31F/L307V的最适温度为85℃,较野生酶提高了5℃,在65℃下半衰期为35 min,较野生酶提高了 1.3倍,但对热稳定性的影响并没有表现出叠加效应。